【摘要】：心血管疾病是全球因疾病引起死亡的首要原因,嚴(yán)重危害人類健康。心血管的發(fā)生發(fā)育涉及到復(fù)雜的分子機制,許多遺傳機制尚不明確。尋找致病基因、探究致病機理并提供可能的治療措施是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的意義所在。本文分兩個部分分別探索了Wdpcp基因?qū)跔顒用}發(fā)育的調(diào)節(jié)機制和表觀遺傳藥物反苯環(huán)丙胺(TCP)糾正心臟流出道畸形的治療效應(yīng)。Wdpcp基因是平面細(xì)胞極性的效應(yīng)基因,在胚胎時期通過影響細(xì)胞運動和初級纖毛生長參與到多種臟器的發(fā)生發(fā)育過程,其純合突變小鼠(Wdpcp~(m/m))呈現(xiàn)無眼,多趾,腸囊腫,腎囊腫,肺動脈閉鎖,房室間隔缺損等一系列畸形,類似臨床上的Bardet Biedl和Meckel Gruber綜合征。本研究發(fā)現(xiàn)Wdpcp基因?qū)τ诠跔顒用}的發(fā)育亦不可或缺。通過SM22α示蹤冠脈平滑肌細(xì)胞,我們發(fā)現(xiàn)Wdpcp純合突變小鼠的冠狀動脈分支減少,平滑肌細(xì)胞數(shù)量明顯下降,而冠狀靜脈的發(fā)育基本不受影響。PECAM免疫組化染色顯示W(wǎng)dpcp基因缺失并不影響冠脈血管叢的形成,相比野生型小鼠血管叢的形成速度反而加快。采用Wt1~(CreERT2)-Rosa26~(mTmG)系統(tǒng)示蹤心外膜細(xì)胞,結(jié)果顯示W(wǎng)dpcp純合突變小鼠胚胎的心外膜來源細(xì)胞(EPDCs)相比野生型小鼠顯著減少,qPCR分析顯示Snail2,Twist1等EMT調(diào)節(jié)基因和Vinculin,Vimentin等間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)明顯降低。3D膠原凝膠實驗證明Wdpcp純合突變小鼠的EPDCs其遷移能力相比野生型小鼠明顯下降。進一步在小鼠中特異性敲除心外膜細(xì)胞的Wdpcp基因,其冠脈缺陷表型與Wdpcp純合突變小鼠相似。以上結(jié)果證明Wdpcp通過促進心外膜細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和遷移過程在冠脈血管叢的重塑階段發(fā)揮作用。本研究首次呈現(xiàn)了一個在冠脈血管叢重塑而非形成過程中發(fā)生缺陷的小鼠模型,將為冠脈血管叢重塑過程中的分子機制研究提供幫助。22q11.2微缺失綜合征(22q11.2DS)是臨床上最常見的染色體微缺失綜合征,常見臨床癥狀有心血管畸形、頭面部畸形、胸腺/甲狀旁腺發(fā)育不良等,其中心血管畸形主要表現(xiàn)為法氏四聯(lián)征、法氏四聯(lián)征合并肺動脈閉鎖,另外的類型有主動脈弓離斷、右室雙出口和永存動脈干等。其致病基因主要是由于T盒轉(zhuǎn)錄基因TBX1的單倍體不足。我們的合作者Baldini教授實驗室在前期實驗中發(fā)現(xiàn)Tbx1可通過招募甲基化轉(zhuǎn)移酶增強組蛋白3賴氨酸4的單甲基化(H3K4me1)從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。在此工作基礎(chǔ)上,我們以Tbx1~(LacZ/+)、Tbx1~(Neo2/LacZ)突變小鼠為研究對象,檢測組蛋白去甲基化酶抑制劑TCP能否糾正Tbx 1缺失造成的心血管畸形。腹腔注射TCP,收取胚胎10.5天Tbx1~(LacZ/+)突變小鼠,通過墨汁注射觀察第Ⅳ咽弓動脈形態(tài),發(fā)現(xiàn)其缺陷比例下降;收取胚胎18.5天Tbx1~(Neo2/LacZ)突變小鼠,觀察心臟流出道形態(tài),發(fā)現(xiàn)TCP可部分糾正永存動脈干畸形,但并不能糾正胸腺缺失的表型。qRT-PCR分析顯示Tbx1的表達(dá)量在TCP處理組和PBS對照組無顯著差別,說明TCP并非通過上調(diào)Tbx1基因本身的表達(dá)量起作用。原位雜交實驗證明TCP處理后第二心域細(xì)胞(SHF)Fgf8的表達(dá)增加,與該結(jié)果一致的是,增殖相關(guān)基因Cyclin D2在SHF細(xì)胞表達(dá)增加,增殖相關(guān)蛋白PHH3磷酸化水平提高。且TCP處理后SHF極性缺失程度減輕,αPKCζ熒光信號重新趨向細(xì)胞頂端分布。本研究為表觀遺傳藥物TCP可糾正Tbx1單倍劑量不足效應(yīng)的理論提供了強有力的體內(nèi)證據(jù),為臨床上22q11.2微缺失綜合征提供一種新的潛在的治療策略。
【圖文】：

Wdpcp 在心外膜細(xì)胞，心肌細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和心臟免疫細(xì)胞中均有表達(dá)[75]（圖1A, 1B）。利用原位雜交的方法進一步證明在胚胎 13.5 天的小鼠心臟 Wdpcp 的表達(dá)非常廣泛（圖 1C）。

圖 2B-2D 中黑色箭頭示 LCA 的 X-gal 染色變淺，圖2B 和 2C 中紅色箭頭所示冠狀動脈主干上染色中斷。而冠狀靜脈（LCV）在突變體中相較于對照組受影響較�。▓D 2B-2D）。采用 Image Pro Plus 軟件定量三對對照組和實驗組胚胎心臟的冠脈平滑肌細(xì)胞在冠脈中的覆蓋率，發(fā)現(xiàn)實驗組冠狀動脈中其平滑肌細(xì)胞覆蓋率顯著低于對照組，而在冠狀靜脈中平滑肌細(xì)胞覆蓋率在兩組中無差別（圖 2E）。同時在突變體中注意到會有異常的短小冠狀動脈起源于主動脈的一側(cè)（圖 2B-2D 的黃色箭頭所示）。為了檢測冠狀動脈室間隔支在突變體中是否形成異常，將心臟放在 1：1 的苯偶酰苯甲酸和水楊酸甲酯中進行透明處理，可以很清楚地看到對照組小鼠的冠狀動脈室間隔支，，而在突變體中卻未觀察到（圖 2G，2H）。以上結(jié)果顯示 Wdpcp 在冠狀動脈形成過程中起重要作用。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R543.3

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本文編號：2623117