發(fā)布時(shí)間：2020-03-12 04:47

【摘要】：背景動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是影響人類健康的一種全身性的慢性疾病,其主要臨床并發(fā)癥如中風(fēng)、心肌梗死、心衰等的發(fā)病率正逐年上升。研究已表明,炎癥反應(yīng)貫穿了 AS發(fā)生發(fā)展的全部階段,包括從斑塊的形成到破裂。但目前針對(duì)AS的治療仍主要集中于降低血清中的脂質(zhì)水平。近年來針對(duì)AS過程中的炎癥介質(zhì)的治療正逐漸增多。二氫辣椒堿(dihydrocapsaicin,DHC)是從紅辣椒中提取的辛辣成分之一,具有鎮(zhèn)痛、抗癌、抗氧化等多種藥理和生理學(xué)作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),DHC能夠通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)/人肝 X 受體 α(Liver X Receptor α,LXRα)通路減少高脂飲食條件下apoE-/-基因敲除小鼠斑塊的形成,同時(shí)下調(diào)小鼠體內(nèi)促炎因子表達(dá)水平。同時(shí)本課題組還發(fā)現(xiàn)在HepG2細(xì)胞系中DHC能夠通過抑制叉頭框蛋白a2(forkhead box a2,Foxa2)并增強(qiáng)LXRα的表達(dá)從而下調(diào)載脂蛋白M(apolipoprotein M,apoM)的表達(dá)。因此,DHC具有預(yù)防心血管疾病特別是抗AS的作用。但是有關(guān)DHC對(duì)于炎癥方面的具體影響目前仍未可知,DHC影響促炎因子表達(dá)的具體機(jī)制也尚不明確。結(jié)果1、DHC能夠上調(diào)NFIA的表達(dá)并抑制NF-κB和促炎因子的表達(dá)本研究發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上,DHC均能夠濃度依賴性地上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞中核轉(zhuǎn)錄因子IA(nuclear factor IA,NFIA)的表達(dá)并抑制核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的表達(dá)。利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)了 THP-1 巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β及IL-6分泌的增多,而DHC抑制了細(xì)胞對(duì)于這些促炎因子的分泌。將apoE-/-基因敲除小鼠隨機(jī)分為DHC組和對(duì)照組,并分別經(jīng)口腔灌胃給藥DHC或無膽固醇植物油。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組小鼠主動(dòng)脈竇部位NFIA表達(dá)上調(diào)而NF-κB的表達(dá)下調(diào),同時(shí)免疫印跡結(jié)果顯示主動(dòng)脈組織中TNF-α、IL-1β及IL-6蛋白水平均有所下調(diào)。2、NFIA能夠抑制NF-κB及促炎因子的表達(dá)通過慢病毒過表達(dá)NFIA后,THP-1巨噬細(xì)胞中NF-κB水平下調(diào)。利用LPS誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞促炎因子分泌,過表達(dá)NFIA后,培養(yǎng)基中細(xì)胞分泌的促炎因子TNF-α、IL-1β及IL-6表達(dá)水平相較于單純LPS誘導(dǎo)組有所下調(diào)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),經(jīng)慢病毒過表達(dá)NFIA的apoE-/-小鼠主動(dòng)脈竇部位NF-κB表達(dá)水平較低,同樣主動(dòng)脈組織中促炎因子TNF-α、IL-1β及IL-6的表達(dá)也低于對(duì)照組。3、DHC通過增強(qiáng)NFIA抑制了 NF-κB的表達(dá)及活性,并最終抑制了促炎因子的表達(dá)免疫印跡結(jié)果顯示,DHC能夠下調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞中NF-κB的表達(dá),而通過慢病毒過表達(dá)NFIA后,DHC導(dǎo)致的NF-κB的下調(diào)作用有所增強(qiáng)。DHC能夠上調(diào)NF-κB抑制劑(inhibitor of NF-κB,IκB)α的表達(dá),同時(shí)過表達(dá)NFIA后,DHC對(duì)IκBα的上調(diào)作用更為增強(qiáng)。DHC抑制了 NF-κB的活性,同時(shí)過表達(dá)NFIA后,DHC抑制NF-κB活性的效應(yīng)更為顯著。同樣,在THP-1巨噬細(xì)胞中,過表達(dá)NFIA后DHC對(duì)于促炎因子釋放的抑制效應(yīng)更為明顯。過表達(dá)NFIA的同時(shí)采用小分子RNA干擾技術(shù)敲減NF-κB的水平,我們發(fā)現(xiàn)NFIA對(duì)促炎因子釋放的抑制作用更為顯著,因此NF-κB可能參與了 NFIA對(duì)于促炎因子的調(diào)控。最后,我們通過小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了過表達(dá)NFIA后能夠增強(qiáng)DHC對(duì)于小鼠血清中促炎因子表達(dá)的抑制作用。結(jié)論DHC能夠通過增強(qiáng)NFIA進(jìn)而抑制NF-κB的表達(dá)及活性,并最終抑制促炎因子的分泌。本研究發(fā)現(xiàn)了 DHC影響促炎因子分泌的分子機(jī)制,為DHC作為治療AS等炎癥性疾病藥物提供了一定的理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

２４小時(shí)后，檢測ＮＦＩＡｍＲＮＡ水平及蛋白水平是否發(fā)生變化。ｑＲＴ－ＰＣＲ逡逑結(jié)果顯示，ＤＨＣ能夠濃度依賴性地上調(diào)ＴＨＰ－１細(xì)胞中ＮＦＩＡ的表達(dá)含量；同樣，逡逑免疫印跡結(jié)果顯示，ＤＨＣ也能夠使蛋白水平產(chǎn)生相應(yīng)變化（圖１－１）。同時(shí)，我逡逑們還檢測了邋ＤＨＣ不同濃度梯度作用下的ＴＨＰ－１巨噬細(xì)胞中ＮＦ－ｋＢ的ｍＲＮＡ及逡逑蛋白水平是否發(fā)生變化，如圖１－２所示，ＤＨＣ同樣能夠濃度依賴性地下調(diào)ＮＦ－ｋＢ逡逑的ｍＲＮＡ及蛋白水平的表達(dá)。為探宄ＤＨＣ對(duì)促炎因子分泌的影響，我們采用逡逑ＬＰＳ誘導(dǎo)ＴＨＰ－１巨噬細(xì)胞的方式構(gòu)建炎癥模型。將ＴＨＰ－１巨噬細(xì)胞分為三組，逡逑分別為對(duì)照組、ｌＯｎｇ／ｍＬ邋ＬＰＳ刺激及ｌＯＯ＾Ｍ邋ＤＨＣ加１０ｎｇ／ｍＬ邋ＬＰＳ三種處理方逡逑式，于３７°Ｃ環(huán)境中培養(yǎng)２４小時(shí)后，采用ＥＬＩＳＡ法檢測細(xì)胞上清中ＴＮＦ－ｏｕ邋ＩＬ－１Ｐ逡逑和ＩＬ－６的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，和對(duì)照組相比，ＬＰＳ刺激后細(xì)胞上清中ＴＮＦ－ｏｕ逡逑３２逡逑

我們首先采用慢病毒過表達(dá)ＴＨＰ－１細(xì)胞中ＮＦＩＡ的水平。將ＴＨＰ－１細(xì)胞逡逑分別轉(zhuǎn)染慢病毒過表達(dá)載體（ＬＶ－ＮＦＩＡ）和慢病毒空載體（ＬＶ－Ｍｏｃｋ），并加入逡逑ＰＭＡ進(jìn)一步誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞，提取相應(yīng)細(xì)胞蛋白進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)。如圖２－１逡逑結(jié)果顯示，與ＬＶ－Ｍｏｃｋ組相比，ＬＶ－ＮＦＩＡ組細(xì)胞中ＮＦ－ｋＢ表達(dá)水平明顯下調(diào)；逡逑另外設(shè)立三組，分別為轉(zhuǎn)染了邋ＬＶ－Ｍｏｃｋ的ＴＨＰ－１巨噬細(xì)胞加ＰＢＳ處理（Ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑組），轉(zhuǎn)染了邋ＬＶ－Ｍｏｃｋ的ＴＨＰ－１巨噬細(xì)胞加１０ｎｇ／ｍＬＬＰＳ處理（ＬＰＳ組），轉(zhuǎn)染逡逑了邋ＬＶ－ＮＦＩＡ邋的邋ＴＨＰ－１邋巨噬細(xì)胞加邋１０ｎｇ／ｍＬ邋ＬＰＳ邋處理（ＬＶ－ＮＦＩＡ＋ＬＰＳ邋組），２４ｈ逡逑后收集細(xì)胞上清，采用ＥＬＩＳＡ法檢測細(xì)胞上清中ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－ｌｐ和ＩＬ－６的表達(dá)逡逑７ｊＣ平。如表２－１所示，與對(duì)照組相比，經(jīng)ＬＰＳ刺激后，上清液中ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－ｌｊ３逡逑和ＩＬ－６的表達(dá)水平均有所上調(diào)，，而同時(shí)過表達(dá)ＮＦＩＡ后，ＬＰＳ刺激所導(dǎo)致的促逡逑炎因子的上調(diào)作用有所減弱。因此
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R543.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2586460