【摘要】：動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,As)是心腦血管疾病發(fā)生的病理基礎(chǔ),嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康。As發(fā)生過(guò)程中,巨噬泡沫細(xì)胞的形成發(fā)揮關(guān)鍵作用,血管平滑肌細(xì)胞(Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs)大量增殖、遷移,是此類(lèi)疾病發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)。外泌體(exosomes)是一類(lèi)直徑大約為30~100 nm由活細(xì)胞分泌產(chǎn)生的膜性囊泡,其內(nèi)攜帶多種物質(zhì),包括蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA等,exosomes內(nèi)攜帶的功能性分子可被其他細(xì)胞攝取,從而調(diào)控細(xì)胞的基因網(wǎng)絡(luò),廣泛參與細(xì)胞間交流。microRNA(miRNA)是真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)內(nèi)源性具有調(diào)控功能的非編碼RNA,其大小約為23個(gè)核苷酸,進(jìn)化上高度保守。通常與靶基因的3’非翻譯區(qū)(3’Untranslated Region,3’UTR)互補(bǔ)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平降解或抑制靶標(biāo)mRNA,實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的表達(dá)調(diào)控。動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中,巨噬泡沫細(xì)胞形成和VSMCs大量增殖及遷移發(fā)揮重要作用,我們探究巨噬泡沫細(xì)胞與VSMCs之間能否通過(guò)exosomes進(jìn)行交流,從而探究VSMCs增殖遷移新機(jī)制。我們首先通過(guò)差速離心法分離并鑒定exosomes;通過(guò)PKH67熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證VSMCs可以攝取巨噬泡沫細(xì)胞源exosomes;通過(guò)miRNA表達(dá)譜檢測(cè)巨噬泡沫細(xì)胞源exosomes中差異表達(dá)的miRNA;以慢病毒為載體過(guò)表達(dá)或抑制miRNA并構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)VSMCs細(xì)胞系,探究mi RNA對(duì)VSMCs增殖及遷移能力的影響;利用生物信息學(xué)和雙熒光素酶報(bào)告基因法預(yù)測(cè)并驗(yàn)證miRNA的靶基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.差速離心法分離exosomes后,透射電鏡觀察形態(tài),其直徑介于30~100 nm之間,呈圓形或杯狀囊泡形態(tài);檢測(cè)exosomes標(biāo)記蛋白CD9,CD63,CD81均呈陽(yáng)性表達(dá);miRNA表達(dá)譜共篩選出188個(gè)與巨噬泡沫細(xì)胞相關(guān)的miRNAs(上調(diào)或下調(diào)大于2倍);與巨噬細(xì)胞源exosomes相比,巨噬泡沫細(xì)胞源exosomes可明顯抑制VSMCs的增殖。2.利用慢病毒載體感染人主動(dòng)脈VSMCs,2μg/ml嘌呤霉素篩選后建立陰性對(duì)照(NC)、miR-483過(guò)表達(dá)組(LV-miR-483)和miR-483-3p抑制組(Anti-miR-483-3p)穩(wěn)轉(zhuǎn)VSMCs細(xì)胞系;與NC組VSMCs相比,LV-miR-483中mi R-483-3p表達(dá)上調(diào)約48倍,說(shuō)明我們成功構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)VSMCs細(xì)胞系。MTT法和EdU法分析細(xì)胞增殖能力,與NC組相比,LV-miR-483組VSMCs增殖能力受到抑制,Anti-miR-483-3p組VSMCs增殖能力明顯增強(qiáng);增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)蛋白水平呈現(xiàn)相同趨勢(shì)。細(xì)胞劃痕損傷法檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-483-3p可顯著抑制VSMCs的遷移,而Anti-mi R-483-3p組VSMCs的遷移能力受到明顯抑制。表明miR-483-3p可抑制VSMCs增殖和遷移。3.利用TargetScanHuman和miRDB生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-483-3p與細(xì)胞增殖調(diào)控相關(guān)的靶基因,發(fā)現(xiàn)OGT和XPO1可能為miR-483-3p靶向調(diào)控基因;雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)雙熒光素酶-OGT 3’UTR表達(dá)載體與miR-483-3p mimics共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性顯著降低;miR-483-3p過(guò)表達(dá)組OGT蛋白水平明顯下調(diào)。上述結(jié)果表明,巨噬泡沫細(xì)胞源exosomes中miR-483-3p通過(guò)靶向OGT抑制VSMCs的增殖遷移,為心血管疾病發(fā)病機(jī)制提供重要的理論依據(jù)。
【圖文】：

的重要病理基礎(chǔ)。1 動(dòng)脈粥樣硬化與血管平滑肌細(xì)胞As 是一類(lèi)發(fā)展緩慢、過(guò)程復(fù)雜的血管炎癥性疾病[1]，其主要特點(diǎn)是脂肪斑塊和纖維斑塊在內(nèi)膜處積聚呈黃色粥樣的斑塊，致使動(dòng)脈管壁增厚、管腔縮小和失去彈性，繼而發(fā)生斑塊破裂、血栓形成等病變。其主要發(fā)生在大、中動(dòng)脈的交叉處和彎流處，吸煙、酗酒、肥胖和膽固醇等均是 As 的誘發(fā)因素。As 發(fā)生過(guò)程中，巨噬泡沫細(xì)胞的形成發(fā)揮關(guān)鍵作用，是 AS 的病理特征。氧化型的低密度脂蛋白(Oxidized Low Density Lipoprotein, ox-LDL)通過(guò)清道夫受體等被巨噬細(xì)胞吞噬形成泡沫細(xì)胞，構(gòu)成 AS 的早期病變。As 形成包括淋巴細(xì)胞的炎癥招募和血管細(xì)胞激活兩個(gè)階段，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和 VSMCs 在其形成過(guò)程中起到重要作用。

置于壓片暗夾的保鮮膜中，暗室中將 X 膠片壓在片結(jié)束后，將 X 膠片放于顯影液中，，直至出現(xiàn)明中 5 min，水洗晾干膠片；，拍照后，使用 Quantity Scan 軟件分析條帶。察 exosomes 形態(tài)結(jié)構(gòu)離心的方法，分離 THP-1 細(xì)胞培養(yǎng)液中的 exos泡具有典型的 exosomes 特征：直徑介于 30~10由于 exosomes 膜由雙層脂質(zhì)構(gòu)成，可見(jiàn)中央色淡
【學(xué)位授予單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R543.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 張燕燕;李亭偉;王莎莎;張晾;;慢病毒載體感染人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的效率[J];濟(jì)南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2016年03期

本文編號(hào)：2560424