【摘要】：背景和目的高原紅細(xì)胞增多癥(high altitude polycythemia,HAPC)是一種高原地區(qū)常見的慢性高原疾病,其主要特征為紅細(xì)胞過度增生,血液中血紅蛋白含量顯著增加,紅細(xì)胞壓積明顯升高,血流變緩,紅細(xì)胞淤積,微循環(huán)功能障礙,導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重的低氧血癥,以及由此帶來的全身多器官多系統(tǒng)損害。高原世居人群和高原移居人群均會(huì)受到HAPC的影響,但是兩個(gè)人群HAPC的發(fā)病率存在顯著的差異。流行病學(xué)研究表明,隨著海拔的升高,HAPC發(fā)病率增加,在同一海拔處,高原移居人群HAPC的發(fā)病率顯著高于高原世居人群,男性的發(fā)病率顯著高于女性。HAPC的診斷標(biāo)準(zhǔn)為:男性Hb≥210 g/L,女性Hb≥190 g/L。慢性缺氧是HAPC的主要病因,但并不是唯一因素。調(diào)查發(fā)現(xiàn),處于同一位置的漢族移居人群,飲食,居住和勞動(dòng)條件類似,年齡相仿,生活習(xí)慣無差異,一部分個(gè)體發(fā)生HAPC,而另一部分個(gè)體不發(fā)生HAPC,提示遺傳因素可能與漢族人群HAPC的發(fā)生有關(guān)。根據(jù)本研究的前期研究結(jié)果,以及文獻(xiàn)報(bào)道,我們重點(diǎn)篩選了包括缺氧誘導(dǎo)因子信號(hào)通路,能量代謝相關(guān)基因以及炎癥因子相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點(diǎn),評(píng)價(jià)與漢族HAPC的相關(guān)性,并從遺傳學(xué)角度,分析基因-基因交互作用,建立預(yù)測(cè)漢族HAPC的最佳模型。材料和方法按照1:1配比原則,在移居青藏高原海拔4000米以上地區(qū)的漢族男性人群中,篩選了234例HAPC患者和250例高原健康對(duì)照,收集樣本基本信息,包括年齡,籍貫,吸煙,飲酒狀態(tài)以及收縮壓(systolic blood pressure,SBP),舒張壓(diastolic blood pressure,DBP),動(dòng)脈血氧飽和度(artery oxygen saturation,Sa O2),心率(heart rate,HR)以及身高體重等臨床資料。在HAPC組中,采用多元逐步回歸分析影響Hb的因素。根據(jù)本課題組的前期研究結(jié)果,篩選了多個(gè)基因的SNP位點(diǎn),采用包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)為基礎(chǔ)的PCR產(chǎn)物直接測(cè)序,瓊脂糖凝膠電泳,高分辨率熔解曲線(high resolution melting,HRM)分析,限制性內(nèi)切酶多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP),二代測(cè)序,連接酶反應(yīng)(ligase detection reaction,LDR)等分析方法,獲取上述基因的SNP位點(diǎn)的基因型。采用卡方檢驗(yàn)分析上述SNP位點(diǎn)基因型與等位基因在HAPC和高原健康對(duì)照組的分布,基因型表型關(guān)聯(lián)由單因素方差分析完成。綜合漢族HAPC患者和高原健康對(duì)照組的基因型數(shù)據(jù),采用廣義多因子降維法(generalized multifactor dimensionality reduction,GMDR)和多因子降維法(multifactor dimensionality reduction,MDR)分析基因-基因間的交互作用,并聯(lián)合logistic回歸分析,構(gòu)建最佳預(yù)測(cè)漢族HAPC的遺傳學(xué)模型。結(jié)果1.與高原健康對(duì)照組相比,HAPC患者的Sa O2顯著降低,而HR,DBP和體重指數(shù)(body mass index,BMI)顯著升高,提示HAPC患者存在嚴(yán)重的低氧血癥,并且提示HAPC患者的心功能可能存在損傷。2.HAPC患者的Hb與Sa O2呈負(fù)相關(guān),與HR,DBP和BMI呈正相關(guān)。3.在α=0.05水準(zhǔn)處,采用多元逐步回歸評(píng)估Sa O2,HR,DBP和BMI對(duì)Hb的影響。所得方程為:Hb=265.772+0.221*DBP-0.691*Sa O2。在HAPC組中,對(duì)Hb影響最大的是Sa O2,其次為DBP。4.在HAPC組中,Hb與吸煙和飲酒狀態(tài)無關(guān),而在高原健康對(duì)照組中,單純飲酒組的Hb高于單純吸煙組,其它狀態(tài)無差異。5.ACE基因D/D基因型可能分型錯(cuò)誤,需要對(duì)D/D基因型再次分型。本研究中初次判定了55例D/D基因型,再次分析時(shí)6例D/D基因型被判定為I/D基因型。本研究中,D/D基因型被判定為I/D基因型的比例為11.3%。6.與HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)的rs11549465和rs11549467,與安第斯山印第安人HAPC有關(guān)的SENP1基因rs726354和VEGFA基因rs3025033與中國漢族HAPC的發(fā)生無關(guān)。7.共顯性模型和顯性模型分析提示CARD14基因rs8065364的三種基因型C/C,C/T,T/T在HAPC組和高原健康對(duì)照組的分布存在顯著差異。共顯性模型分析提示:C/T vs T/T(OR=1.61,95%CI=1.10-2.38),C/C vs T/T(OR=2.19,95%CI=1.23-3.89),p=0.006。顯性模型分析提示:C/T+C/C vs T/T(OR=1.74,95%CI=1.21-2.49),p=0.003。ULK4基因多態(tài)性位點(diǎn)rs9842536中,C與T兩種等位基因在HAPC組和高原健康對(duì)照組的分布存在明顯差異(p=0.024),T等位基因是漢族HAPC發(fā)生的保護(hù)因素(OR=0.73;95%CI=0.56-0.96)。CARD14基因多態(tài)性位點(diǎn)rs8065364中,C與T兩種等位基因在HAPC組和高原健康對(duì)照組的分布存在明顯差異(p=0.0009),C等位基因(OR=1.59;95%CI=1.21-2.08)是漢族HAPC發(fā)生的危險(xiǎn)因素。8.HDAC5基因多態(tài)性位點(diǎn)rs8065686的C/T基因型是中國漢族人群HAPC的危險(xiǎn)因素(OR=1.71,95%CI=1.11-2.62),但是等位基因頻率分析提示C和T等位基因在漢族HAPC組和高原健康對(duì)照組的分布并無差異。HSPA1L基因多態(tài)性位點(diǎn)rs2227956的C/T基因型是中國漢族人群HAPC的危險(xiǎn)因素(OR=1.62,95%CI=1.10-2.39),但是等位基因頻率分析提示C和T等位基因在漢族HAPC組和高原健康對(duì)照組的分布并無差異。9.Glut1基因多態(tài)性位點(diǎn)rs1385129三種基因型在HAPC組和高原健康對(duì)照組的分布存在顯著差異,與G/G基因型相比,A/G基因型是漢族HAPC保護(hù)因素(OR=0.63,95%CI=0.43-0.94),等位基因分析提示A等位基因是漢族HAPC的保護(hù)因素(OR=0.69,95%CI=0.51-0.92)。rs2086856三種基因型在HAPC和高原健康對(duì)照組之間的分布存在顯著差異,與G/G基因型相比,A/A基因型是漢族HAPC的危險(xiǎn)因素(OR=1.84,95%CI=1.08-3.13),等位基因分布提示A等位基因是漢族HAPC的危險(xiǎn)因素(OR=1.42,95%CI=1.09-1.83)。rs841853三種基因型在HAPC和高原健康對(duì)照組之間的分布不存在差異,等位基因分析提示G等位基因可能是漢族HAPC的危險(xiǎn)因素(OR=1.45,95%CI=1.06-1.98)。10.PDHX基因多態(tài)性位點(diǎn)rs2767035三種基因型在HAPC和高原健康對(duì)照組之間的分布存在顯著差異,與T/T基因型相比,C/T基因型是漢族HAPC的危險(xiǎn)因素(OR=1.68,95%CI=1.15-2.45),但是等位基因頻率分析提示C和T等位基因在漢族HAPC組和高原健康對(duì)照組的分布并無差異。LDHA基因多態(tài)性位點(diǎn)rs3758682三種基因型在漢族HAPC組和高原健康對(duì)照組之間沒有差異,等位基因頻率分析提示C等位基因可能是漢族HAPC的危險(xiǎn)因素(OR=1.31,95%CI=1.00-1.71)。11.ADORA2B基因多態(tài)性位點(diǎn)rs2779212和rs2015353三種基因型在HAPC和高原健康對(duì)照組之間的分布無差異。等位基因分析提示,rs2779212的C等位基因是漢族HAPC的保護(hù)因素(OR=0.72,95%CI=0.53-0.96),rs2015353的A等位基因可能是漢族HAPC的危險(xiǎn)因素(OR=1.56,95%CI=1.06-2.28)。UCP1基因多態(tài)性位點(diǎn)rs6818140三種基因型在HAPC和高原健康對(duì)照組之間的分布無差異,等位基因分析提示A等位基因可能是漢族HAPC的保護(hù)因素(OR=0.69,95%CI=0.49-0.97)。12.基因-基因交互作用分析提示rs726354,rs3025033和rs8065364三者之間的協(xié)同效應(yīng)可能參與了漢族HAPC的發(fā)生。綜合分析EPAS1基因型數(shù)據(jù)以及能量代謝相關(guān)基因,炎癥因子相關(guān)基因多態(tài)性數(shù)據(jù)后,本研究的最終結(jié)果表明CARD14基因多態(tài)性位點(diǎn)rs8065364,Glut1基因多態(tài)性位點(diǎn)rs2086856二者組合可能是預(yù)測(cè)男性漢族HAPC的最佳模型,而這兩個(gè)位點(diǎn)之間相互作用的負(fù)效應(yīng)可能與男性漢族HAPC的發(fā)生有關(guān)。在男性中國漢族人群中,以rs2086856的A/A基因型和rs8065364的T/T基因型為參照,攜帶rs2086856的A/G基因型和rs8065364的C/T基因型發(fā)生HAPC的風(fēng)險(xiǎn)增加1.98倍。結(jié)論中國漢族人群的HAPC存在遺傳易感性,這種遺傳易感性可能存在于能量代謝信號(hào)通路,炎癥信號(hào)調(diào)控通路以及氧感知信號(hào)通路相關(guān)基因中。CARD14基因SNP rs8065364的C等位基因,Glut1基因SNPrs2086856的A等位基因,SNPrs841853的G等位基因,LDHA基因SNPrs3758682的C等位基因以及ADORA2B基因SNPrs2015353的A等位基因是中國漢族人群HAPC的危險(xiǎn)因素。ULK基因SNPrs9842536的T等位基因,Glut1基因SNPrs1385129的A等位基因,ADORA2B基因SNPrs2779212的C等位基因,以及UCP1基因SNPrs6818140的A等位基因是中國漢族人群HAPC的保護(hù)因素。rs726354,rs3025033和rs8065364之間的協(xié)同效應(yīng),rs8065364和rs2086856之間的負(fù)效應(yīng)與中國漢族人群HAPC有關(guān)。能量代謝信號(hào)通路,炎癥信號(hào)調(diào)控通路以及氧感知信號(hào)通路相關(guān)基因的交互作用,可能參與了中國漢族人群的HAPC的發(fā)生。
【圖文】：

第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文中，頻率較高。而在那些不發(fā)生 HAPE 的個(gè)體中，攜帶 I/I 基因型的個(gè)體數(shù)另外，在漢族人群的急性高原病（acute mountain sickness, AMS）中，ACE 等位基因是危險(xiǎn)因素[23]。但是在尼泊爾人群[24]和歐洲人群[25]中，并沒有看到的 I/D 多態(tài)性與 AMS 有關(guān)。鑒于 ACE 基因 I/D 多態(tài)性導(dǎo)致明顯的生物學(xué)效同時(shí)尚無 ACE 基因 I/D 多態(tài)性與漢族 HAPC 的相關(guān)性研究，因此，我們將 I/D 多態(tài)性納入本研究。2.2.2 缺氧誘導(dǎo)因子-1α 基因多態(tài)性的篩選在 Genebank 數(shù)據(jù)庫中，人類缺氧誘導(dǎo)因子 1α（hypoxia inducible factor -1α）基因定位于 14 號(hào)染色體上，具體位置為 14q23.2，一共有 16 個(gè)外顯子， 序 列 號(hào) 為 NC_000014.9 ， 基 因 ID 號(hào) 為 3091， 染 色 體 范 圍 為 ch95401..61748259，全長(zhǎng)約 52.8kb（圖 2.2.2）。

GIH (G) 81.2 (82) 16.8 (17) 2.0 (2) 101 89.6 (181) 10.4 (21) 202JPT (J) 70.8 (80) 24.8 (28) 4.4 (5) 113 83.2 (188) 16.8 (38) 226LWK (L) 48.2 (53) 46.4 (51) 5.5 (6) 110 71.4 (157) 28.6 (63) 220MEX (M) 51.7 (30) 43.1 (25) 5.2(3) 58 73.3 (85) 26.7 (31) 116MKK (K) 62.2 (97) 32.7 (51) 5.1 (8) 156 78.5 (245) 21.5 (67) 312TSI (T) 75.5 (77) 22.5 (23) 2.0 (2) 102 86.8 (177) 13.2 (27) 204YRI (Y) 53.1 (78) 44.9 (66) 2.0 (3) 147 75.5 (222) 24.5 (72) 2942.2.4 熱休克蛋白 A1 樣基因多態(tài)性篩選在 Genebank 數(shù)據(jù)庫中，，人類熱休克蛋白 A1 樣（heat shock protein family A (Hsp7ember 1 like，HSPA1L）基因定位于 6 號(hào)染色體上，具體位置為 6p21.3，一共有 5 顯子，基因參考序列號(hào)為 NC_000006.12 ，基因 ID 號(hào)為 3305，染色體范圍為 chr1809619..31821999，全長(zhǎng)約 12.3kb（圖 2.2.4）。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R555.1


本文編號(hào)：2552243