【摘要】：研究目的:主動(dòng)脈中膜退化和血管平滑肌細(xì)胞功能失調(diào)是引起主動(dòng)脈夾層的主要原因,細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白four and half LIM domain 1(FHL1)蛋白在主動(dòng)脈夾層中表達(dá)下調(diào),而且下調(diào)其表達(dá)抑制了主動(dòng)脈血管平滑肌的增殖。FAK(focal adhesion kinase)信號(hào)通路介導(dǎo)體內(nèi)多信號(hào)通路,在細(xì)胞增殖、遷移和信號(hào)導(dǎo)方面發(fā)揮重要作用。有研究報(bào)道,FHL1間接參與了FAK介導(dǎo)的整合素信號(hào)通路,并且在某些疾病模型中與FAK通路的相關(guān)蛋白發(fā)生相互作用。本課題通過檢測(cè)FHL1與FAK通路相關(guān)蛋白的表達(dá)及其調(diào)節(jié)細(xì)胞功能等方面展開研究,明確了FHL1與FAK信號(hào)通路在調(diào)節(jié)主動(dòng)脈壁重構(gòu)中相關(guān)關(guān)系,探討了FHL1參與夾層發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制。研究方法:收集正常主動(dòng)脈和夾層患者的主動(dòng)脈組織,常規(guī)提取組織蛋白并進(jìn)行蛋白定量。采用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blotting,WB)實(shí)驗(yàn)方法,檢測(cè)并比較FHL1和Paxillin蛋白兩組主動(dòng)脈脈組織中的表達(dá)。再利用免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)明確FAK相關(guān)蛋白在主動(dòng)脈中的分布以及FHL1蛋白與Paxillion蛋白表達(dá)的相關(guān)性。構(gòu)建并包裝調(diào)控FHL1蛋白表達(dá)的腺病毒轉(zhuǎn)染人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(human aorta vascular smooth muscle cell,HASMC),采用實(shí)時(shí)定量PCR(Q-RT-PCR)檢測(cè)病毒對(duì)FHL1 mRNA水平的調(diào)控,并利用Western blotting測(cè)定靶向調(diào)控FHL1表達(dá)的腺病毒對(duì)FHL1蛋白的調(diào)控效果;于此同時(shí),采用CCK-8檢測(cè)過表達(dá)FHL1蛋白與使用FAK抑制劑下調(diào)FAK表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響。同樣,采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察過表達(dá)FHL1蛋白與使用FAK抑制劑下調(diào)FAK表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移的影響。構(gòu)建并包裝下調(diào)FHL1蛋白表達(dá)的腺相關(guān)病毒,通過尾靜脈注射注入小鼠體內(nèi),用以轉(zhuǎn)染小鼠主動(dòng)脈,采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)和Western blotting實(shí)驗(yàn)分別在mRNA水平和蛋白表達(dá)水平檢測(cè)腺相關(guān)病毒下調(diào)FHL1表達(dá)的效果。同時(shí)構(gòu)建小鼠主動(dòng)脈夾層模型,通過觀察小鼠死亡率、夾層發(fā)生率和主動(dòng)脈中膜的厚度,驗(yàn)證FHL1對(duì)夾層發(fā)生的影響結(jié)果:FHL1蛋白與Paxillin蛋白在人體主動(dòng)脈組織標(biāo)準(zhǔn)中均表達(dá)低與正常人,而且Paxillin蛋白與FHL1蛋白均定位于主動(dòng)脈中膜層和主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞質(zhì)中。靶向調(diào)控FHL1的腺病毒能有效調(diào)控mRNA水平及蛋白表達(dá),CCK8檢測(cè)上調(diào)FHL1表達(dá),能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖,而下調(diào)FAK表達(dá)可以抑制FHL1的促細(xì)胞增殖效應(yīng)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果與細(xì)胞增殖結(jié)果相似,下調(diào)FAK表達(dá)可逆反FHL1蛋白的促細(xì)胞遷移效應(yīng)。靶向調(diào)控干擾FHL1表達(dá)的腺相關(guān)病毒,降低了小鼠主動(dòng)脈FHL1的mRNA水平和下調(diào)了FHL1的蛋白表達(dá)。FHL1下調(diào)組小鼠的死亡率和夾層發(fā)生率都顯著高于對(duì)照組,而且其中膜厚度也較對(duì)照組明顯增加。結(jié)論:FHL1參與主動(dòng)脈血管重塑過程可能與FAK信號(hào)通路有關(guān),其能夠通過調(diào)控FAK信號(hào)通路來促進(jìn)了HASMC細(xì)胞的增殖與遷移,進(jìn)而影響主動(dòng)脈夾層的發(fā)生和發(fā)展。
【圖文】：

圖 1 BCA 蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線所示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白 OD 值與已知的標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度獲得了 BCA 蛋白定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線和該曲線的線性方程。R2為相關(guān)系數(shù)，R2＞0.99 表示該標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好可行度和明顯的。、

圖 2AD 組與正常組主動(dòng)脈組織標(biāo)本靶蛋白的含量比較與正常組主動(dòng)脈組織中靶蛋白（FHL1、Paxillin 蛋白）及內(nèi)參蛋白 β-tu 組條帶構(gòu)成夾層組，右邊 4 個(gè)條帶為正常組，32kd、68kd、55kd 為三組
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R543.1

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本文編號(hào)：2550821