【摘要】：實(shí)驗(yàn)?zāi)康模汗菢虻鞍资求w內(nèi)一種多種功能的細(xì)胞因子,參與集體多種生物學(xué)活動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白與心肌纖維化有著密切聯(lián)系。在原發(fā)性擴(kuò)張型心肌病心臟組織以及壓力負(fù)荷增大而引起擴(kuò)張型心肌病的心臟組織中均發(fā)現(xiàn)OPN表達(dá)量有異常增高。有研究報(bào)道,心肌細(xì)胞過(guò)量表達(dá)OPN能誘發(fā)擴(kuò)張型心肌病的發(fā)生。黏著斑激酶是胞漿內(nèi)的一種酪氨酸激酶,在細(xì)胞的遷移增殖以及生存方面起重要作用。并且參與OPN相關(guān)的的信號(hào)通路。我們實(shí)驗(yàn)主要目的是探究OPN在擴(kuò)張型心肌病的病理,以及OPN與FAK在擴(kuò)張型心肌病心肌纖維化和心肌重構(gòu)中的作用。實(shí)驗(yàn)方法：選用自發(fā)性擴(kuò)張型心肌病小鼠模型cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。8周大小時(shí)進(jìn)行開(kāi)胸手術(shù),并在心臟左心室游離壁注射載有OPN-shRNA的慢病毒,達(dá)到沉默心肌組織表達(dá)OPN的效果。實(shí)驗(yàn)分為3組,假手術(shù)組,僅進(jìn)行手術(shù),不注射藥物。對(duì)照病毒組,注射不含shRNA的對(duì)照病毒,OPN-shRNA抑制組,注射含有OPN-shRNA的慢病毒。4周后進(jìn)行小鼠超聲檢測(cè)評(píng)價(jià)心臟擴(kuò)張程度以及左室功能。取材,提取蛋白和mRNA進(jìn)行western blot以及PCR實(shí)驗(yàn),以檢驗(yàn)心臟組織Ⅰ型膠原纖維和磷酸化FAK的表達(dá)。用MASSON染色的方法檢測(cè)心肌纖維化和心室重構(gòu)程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：OPN-shRNA抑制組的小鼠射血分?jǐn)?shù),左室短軸縮短率較高,收縮期左室前壁較厚,表明OPN抑制有助于擴(kuò)張型心肌病的心功能改善。Masson染色顯示OPN-shRNA抑制組小鼠心肌纖維化明顯輕于另外兩組。此外western blot, PCR結(jié)果顯示OPN-shRNA抑制組的小鼠a-SMA,Ⅰ型膠原以及磷酸化FAK, Akt表達(dá)較少。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：抑制擴(kuò)張型心肌病心肌組織中OPN的表達(dá),能達(dá)到減輕心肌纖維化的程度,減少心室重構(gòu),增強(qiáng)擴(kuò)張型心肌病心臟功能的作用。黏著斑激酶(Focal Adhesion Kinase, FAK)是一種非酪氨酸激酶,在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中處于十分重要的位置,參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)以及細(xì)胞存活。在近年來(lái)的研究中發(fā)現(xiàn),FAK與各器官的纖維化存在著重要的作用。我們假設(shè),骨橋蛋白(osteopontin,OPN)一種與纖維化關(guān)系緊密的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,能夠刺激成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白,并且這一過(guò)程是經(jīng)過(guò)FAK介導(dǎo)的。因此我們提取小鼠乳鼠心臟成纖維細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證這一假設(shè),用骨橋蛋白刺激小鼠成纖維細(xì)胞,并且在刺激前12小時(shí)給予FAK抑制劑抑制FAK活性。用western blot和ELISA方法分別檢測(cè)胞質(zhì)內(nèi)和細(xì)胞上清液Ⅰ型膠原的含量,用免疫熒光方法檢測(cè)α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA).實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,OPN能導(dǎo)致成纖維細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原蛋白和α平滑肌肌動(dòng)蛋白,并且這種作用能被FAK抑制劑所減弱。我們得出結(jié)論,FAK能夠在OPN誘導(dǎo)小鼠心臟成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞以及心臟的纖維化過(guò)程中起重要作用。這一發(fā)現(xiàn)有可能對(duì)于纖維化治療靶點(diǎn)的研究有重要指導(dǎo)作用。
【圖文】：

圖２：小鼠也肌沮織０ＰＮ表達(dá)逡逑

澩锝锨浚嘌鈃笛榫讜蚧犸醪槐澩錚希桑蓿危rPㄑ糶裕]3?面積，，假手術(shù)組２．邋９６邋＋１．０２％，對(duì)照病毒組３．邋１９邋＋邋１．邋５９％邋ＶＳ．實(shí)驗(yàn)組０．２１邋±０．１４％，逡逑ｐ＜０．０５，圖３）。這與ＰＣＲ結(jié)果（圖４）保持一致，表明實(shí)驗(yàn)中ｓｈＲＮＡ能夠?qū)σ布〗M逡逑織表達(dá)０ＰＮ進(jìn)行有效的抑制。逡逑假手術(shù)沮邐對(duì)照病毒組邐實(shí)驗(yàn)組逡逑邐（ｎ二邋６）邐（ｎ＝６）邐（ｎ＝６）邐逡逑ＢＷ（ｇ）邐２２．４３邋＋邋１．３３邐２２．６４＋１．４９邐２２．４８邋＋邋０．８７逡逑ＬＶＡＷ：ｄ邐０．８１
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R542.2

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本文編號(hào)：2550614