【摘要】：心血管疾病是威脅人類健康的頭號(hào)殺手,心肌肥厚是多種心血管疾病共有的病理特征之一。它是指心臟對(duì)于各種機(jī)械應(yīng)力或者神經(jīng)激素刺激的一種代償性反應(yīng),表現(xiàn)為心臟尺寸的增大和室壁的增厚。心肌肥厚的程度對(duì)于進(jìn)行性心臟疾病具有重要的預(yù)測作用并且與預(yù)后負(fù)相關(guān),病理性心肌肥厚最終發(fā)展為心力衰竭是導(dǎo)致心肌肥厚患者死亡的主要原因。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多重要的參與調(diào)控心肌肥厚發(fā)生發(fā)展的信號(hào)通路,但是其發(fā)生的分子機(jī)制還有待更加深入的研究。因此,研究發(fā)現(xiàn)新的心肌肥厚調(diào)控基因,為心肌肥厚的治療尋找新的靶標(biāo),對(duì)于預(yù)防和治療心臟疾病具有重要的意義。病理性心肌肥厚的發(fā)生和發(fā)展往往伴隨著心臟穩(wěn)態(tài)的失衡,而近年來的研究表明自噬在心臟穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮了極為重要的功能。自噬是指細(xì)胞自身的蛋白或者細(xì)胞器被雙層膜結(jié)構(gòu)包被形成自噬體,進(jìn)而與溶酶體融合形成自噬溶酶體,最終溶解這些內(nèi)容物的過程。通過自噬可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞自身能量代謝及細(xì)胞器更新的需求,因此它是一種維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要生理過程。心肌細(xì)胞自噬的異常與心肌肥厚的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),但是由于自噬功能的復(fù)雜性,利用遺傳修飾小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)不同的自噬功能基因在心肌肥厚中的功能是不同的,關(guān)于自噬究竟是促進(jìn)心肌肥厚還是抑制心肌肥厚這一問題還存在較大的爭議。microRNA(miRNA)是一類長度大約為22個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA,廣泛地參與了各種重要的細(xì)胞生物學(xué)過程。它們可以與靶基因mRNA 3’非翻譯區(qū)以堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別并結(jié)合,通過抑制蛋白的翻譯或促進(jìn)mRNA的降解兩種方式,對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)。近年來國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)了一系列在心肌肥厚中發(fā)揮重要功能的mi RNA,它們通過調(diào)節(jié)在心肌肥厚中重要的信號(hào)通路從而在心肌肥厚中起到有益或有害的作用。通過對(duì)這些mi RNA的研究也發(fā)現(xiàn)了新的可能的心肌肥厚及心衰的臨床診斷指標(biāo)及治療靶標(biāo)。miR-199a是一個(gè)重要的心肌細(xì)胞尺寸調(diào)控基因。之前的研究發(fā)現(xiàn),miR-199a在心衰病人標(biāo)本及病理性心肌肥厚小鼠模型中的表達(dá)均有顯著性的上調(diào)。體外研究結(jié)果顯示miR-199a在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞尺寸及凋亡中發(fā)揮了重要的功能,但是關(guān)于miR-199a在小鼠體內(nèi)心臟穩(wěn)態(tài)維持中是否發(fā)揮功能以及相關(guān)的作用機(jī)制均未見報(bào)道。本研究旨在研究miR-199a的體內(nèi)功能,并探索其引發(fā)病理性心肌肥厚的分子機(jī)制。我們首先在主動(dòng)脈結(jié)扎引起的小鼠心肌肥厚模型及心衰病人標(biāo)本中驗(yàn)證了miR-199a的表達(dá),發(fā)現(xiàn)其表達(dá)均有顯著性的上調(diào)。為了研究miR-199a在體內(nèi)的功能,我們建立了心肌細(xì)胞特異性mir-199a過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生了病理性心肌肥厚及心衰。分子機(jī)制研究顯示,mir-199a在體內(nèi)外過表達(dá)均可以激活自噬抑制因子mtor,抑制心肌細(xì)胞自噬,并且這些生物學(xué)效應(yīng)是部分通過mir-199a的靶基因gsk3β所介導(dǎo)的。進(jìn)一步在體內(nèi)外分別通過雷帕霉素處理或者過表達(dá)atg5激活自噬過程,發(fā)現(xiàn)可以挽救由mir-199a過表達(dá)所引起的心肌肥厚表型,這些結(jié)果證實(shí)mir-199a可以通過抑制心肌細(xì)胞自噬引起病理性心肌肥厚。以上結(jié)果顯示,心肌細(xì)胞特異性mir-199a過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠能夠自發(fā)的發(fā)生病理性心肌肥厚,而以往有文獻(xiàn)報(bào)道心肌細(xì)胞特異性mir-199b轉(zhuǎn)基因小鼠在壓力負(fù)荷下也更容易發(fā)生心肌肥厚,提示mir-199家族是一個(gè)重要的心肌肥厚調(diào)控家族。然而這些研究都是基于體內(nèi)過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的實(shí)驗(yàn)證據(jù),心肌細(xì)胞內(nèi)源的mir-199家族在心臟中發(fā)揮了怎樣的功能鮮見報(bào)道。為了進(jìn)一步研究內(nèi)源性mir-199在心臟穩(wěn)態(tài)維持中的功能,我們建立了一種基于“mirnasponge”策略抑制內(nèi)源性mir-199功能的基因工程小鼠(mir-199-sp)。通過檢測發(fā)現(xiàn)mir-199a和mir-199b在mir-199-sp小鼠心臟組織中表達(dá)下調(diào),而mir-199家族靶基因gsk3β、hif1α和dyrk1a表達(dá)顯著上調(diào),這些結(jié)果證明mir-199-sp小鼠心臟中mir-199家族的功能被有效抑制。對(duì)mir-199-sp轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行表型分析發(fā)現(xiàn),三月齡轉(zhuǎn)基因小鼠開始出現(xiàn)心臟質(zhì)量增加,心肌細(xì)胞尺寸增大,但心肌肥厚的程度并不隨著年齡增長更加顯著。心臟超聲結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因小鼠心臟功能較對(duì)照小鼠無明顯異常。mir-199-sp小鼠心臟肥大標(biāo)志基因anf表達(dá)顯著下調(diào),bnp表達(dá)無明顯變化。masson染色結(jié)果顯示mir-199-sp轉(zhuǎn)基因小鼠未發(fā)生纖維化等病理性重塑。分子機(jī)制研究顯示pgc1α是mir-199的靶基因,在mir-199-sp轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)升高,其調(diào)控的代謝基因上調(diào)可能是小鼠發(fā)生生理性心肌肥厚的機(jī)制之一。以上結(jié)果表明,mir-199-sp轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生了生理性心肌肥厚,提示內(nèi)源性mir-199家族在心臟穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮了重要的功能。最后,為了探索mir-199家族是否能夠成為心肌肥厚治療的靶標(biāo),我們利用主動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)建立的病理性心肌肥厚小鼠模型進(jìn)行了治療實(shí)驗(yàn)。通過鼠尾靜脈注射表達(dá)mir-199-sp序列的腺病毒后發(fā)現(xiàn),抑制mir-199功能可以有效地緩解由于壓力型負(fù)荷增加引起的心肌細(xì)胞尺寸的增加、肥大標(biāo)志基因的上調(diào)和心臟功能的受損,這些結(jié)果表明抑制mir-199可以有效治療壓力型負(fù)荷引起心肌肥厚及心衰。綜上所述,我們利用遺傳修飾的小鼠模型首次在體內(nèi)證實(shí)了mir-199家族在心肌肥厚及心臟穩(wěn)態(tài)維持中的重要功能。發(fā)現(xiàn)mir-199a過表達(dá)靶向調(diào)節(jié)gsk3β抑制心肌細(xì)胞自噬并引起病理性心肌肥厚,而抑制內(nèi)源性mir-199家族引發(fā)生理性心肌肥厚,同時(shí)證明miR-199家族有可能成為心肌肥厚治療的新靶標(biāo)。該研究為理解心肌肥厚的發(fā)生機(jī)制提供了新的認(rèn)識(shí),并為心肌肥厚的治療提供了新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。
【圖文】：

圖 1-1 生理性心肌肥厚與病理性心肌肥厚特征概覽[5]正常心臟中，脂肪酸氧化是心臟能量代謝的主要來源，心臟消耗的來源于脂肪酸氧化，，其余的 ATP 主要來源于葡萄糖和乳糖代謝。血流中的物質(zhì)供應(yīng)及心臟的工作負(fù)擔(dān)改變對(duì)底物的需求，這是心臟

圖 1-3 調(diào)節(jié)心肌肥厚的 miRNA 及其作用的靶基因1.2.2 miRNA 作為心肌肥厚的診斷指標(biāo)盡管早在 1948 年研究者就在血漿中發(fā)現(xiàn)了有 RNA 的存在[67]，但是直到
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R542.2

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2 黃耀;基于miR-199調(diào)控靶向肝癌細(xì)胞的溶瘤腺病毒系統(tǒng)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2012年

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1 宋曉偉;MiR-1和miR-199在心肌肥厚中的功能和機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2009年

本文編號(hào)：2550112