【摘要】：作為心血管疾病的主要危險因素之一，鹽在高血壓的發(fā)病機制和治療方法中起到了顯著作用。在鹽敏感高血壓個體中，鹽負(fù)荷過重導(dǎo)致的血壓升高影響了60歲以上的三分之二的高血壓患者。已有學(xué)者提出腎臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)是兩個主要的鹽濃度感受部位，但具體的分子機制尚不清楚。已有模擬鹽敏感高血壓人群的鹽敏感高血壓大鼠模型—Dahl’s大鼠用以研究鹽敏感高血壓的分子水平的機制。 隨著一半以上的高血壓患者為鹽敏感個體，提高對降低鹽敏感性的策略，尤其是在高危人群中，顯得十分必要。據(jù)報道，無論是在高血壓個體還是在正常血壓個體，限制鹽的攝入既可降低收縮壓，又可降低舒張壓，而在高血壓個體中血壓下降的幅度更大。然而，基于鹽依賴的對血壓的調(diào)節(jié)的分子機制仍有待于完善。目前，除了腎素-血管緊張素系統(tǒng)、血管平滑肌和內(nèi)皮系統(tǒng)之外，一些內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌系統(tǒng)的因子也開始被重視起來。之前的研究為高鹽降低鹽敏感大鼠的腎臟、背根神經(jīng)節(jié)和腸系膜動脈TRPV4通道的功能和表達(dá)提供了有力的證據(jù)。我們以下將探討在鹽敏感高血壓大鼠神經(jīng)元TRPV4通道表達(dá)和功能的變化。 方法： 1.對鹽敏感下丘腦大鼠神經(jīng)元進(jìn)行培養(yǎng)； 2.對大鼠下丘腦的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光化學(xué)染色，觀察TRPV4在細(xì)胞上的存在情況； 3.應(yīng)用膜片鉗技術(shù)觀察TRPV4通道的激動劑、拮抗劑以及高鹽對鹽敏感大鼠神經(jīng)元動作電位的影響。 4.應(yīng)用免疫印跡法檢檢測高鹽對大鼠下丘腦TRPV4通道的蛋白表達(dá)的影響。 5.應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測高鹽對大鼠下丘腦TRPV4通道的mRNA表達(dá)的影響。 6.對室旁核腦注射TRPV4通道的激動劑和拮抗劑，評價其對循環(huán)的影響。 實驗結(jié)果： 1.免疫熒光染色提示SD大鼠和Dahl’S大鼠下丘腦神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上存在TRPV4通道提供了證據(jù)； 2. GSK使正常鹽溶液和高鹽溶液培養(yǎng)的神經(jīng)元動作電位均減少：GSK在正常鹽溶液培養(yǎng)的SD大鼠中神經(jīng)元（NNSSD）和高鹽溶液培養(yǎng)的SD大鼠中神經(jīng)元（NHSSD）中，其自發(fā)性動作電位的減少無顯著性差異，分別為0.518±0.035、0.382±0.049（P0.05，n=5）。GSK在正常鹽溶液培養(yǎng)的Dahl’S大鼠神經(jīng)元（NNSDS）和高鹽溶液培養(yǎng)的Dahl’S大鼠神經(jīng)元（NHSDS）中，其自發(fā)性動作電位的減少存在顯著性差異，分別為0.821±0.042、0.596±0.024（P0.05,n=5）； 3. RuR使正常鹽溶液和高鹽溶液培養(yǎng)的神經(jīng)元動作電位均增加：RuR在NNSSD和NHSSD中，其自發(fā)性動作電位的減少無顯著性差異，分別為0.671±0.203、0.513±0.100(P0.05,n=5)。RuR在NNSDS和NHSDS中，其自發(fā)性動作電位的減少存在顯著性差異，分別為2.344±0.32、1.667±0.261(P0.05,n=5)； 4.免疫印跡法檢測（Western blot）大鼠下丘腦中TRPV4通道蛋白表達(dá)的改變： GAPDH作為內(nèi)參，我們檢測到一條約100KDa的條帶，即為TRPV4通道蛋白。在下丘腦神經(jīng)元和PVN組織的TRPV4通道蛋白表達(dá)中，我們得到了一致的結(jié)果。在神經(jīng)元組分別為：在神經(jīng)元的研究中：NNSDS組與NNSSD組相比，NNSDS組蛋白表達(dá)顯著高于NNSSD組（0.860±0.251vs0.334±0.224, p0.05,n=5）；NHSDS組與NNSDS組相比，NHSDS組TRPV4蛋白表達(dá)明顯低于NNSDS組（0.860±0.251vs0.395±0.251, p0.05, n=5）；而NNSSD組與NHSSD組相比，蛋白含量則無顯著差異（0.334±0.224vs0.295±0.310, p0.05, n=5）。在PVN蛋白組，正常飲食組SD大鼠（SDNS）與高鹽飲食組的SD大鼠（SDHS）蛋白表達(dá)無明顯差異，分別為0.444±0.0.056、0.407±0.080(p0.05,n=5)；而在正常飲食組的Dahl’S大鼠（DSNS）與高鹽飲食組的Dahl’S大鼠（DSHS）蛋白表達(dá)存在明顯差異，分別為0.615±0.096、0.359±0.043(p0.05,n=5)。 5．在Dahl’S大鼠下丘腦神經(jīng)元中，NNSDS組TPRV4mRNA表達(dá)水平顯著高于NHSDS組（1.862±0.130vs1.152±0.130，n=5, p0.05）；NNSDS組TPRV4mRNA表達(dá)水平顯著高于NNSSD(1.862±0.130vs1, n=5, p0.05),說明NNSDS組的TRPV4mRNA表達(dá)水平明顯高于NHSDS組，高鹽降低了Dahl’S大鼠下丘腦神經(jīng)元的TRPV4mRNA的表達(dá)，但對SD大鼠下丘腦神經(jīng)元的TRPV4mRNA的表達(dá)沒有影響。在大鼠的PVN組織中TRPV4mRNA表達(dá)情況的研究中，我們得到了一致的結(jié)果，DSNS組PVN組織中TRPV4mRNA明顯高于DSHS組（3.061±0.186vs0.894±0.150, p0.05, n=5）,說明高鹽飲食降低了Dahl’S大鼠PVN組織中TRPV4mRNA的表達(dá)水平；而高鹽飲食對SD大鼠PVN組織中TRPV4mRNA的水平則無顯著影響（1.142vs1， p0.05, n=5）。 6．在PVN中TRPV4通道的活化作用：對大鼠進(jìn)行GSK PVN微量注射時，與SDNS組(21.3±2.0mmHg)， SDHS組(15.9±2.8mmHg)和DSHS組(26.05±1.4mmHg)相比，DSNS組(50.3±3.6mmHg)血壓下降幅度最大（P0.05，n=5)。GSK腦注射引起心率下降，在DSNS組(126.6±9.6bpm; n=5, P0.05)最為明顯。SDNS組、SDHS組及DSHS組分別為(47.0±3.9bpm),(41.5±2.5bpm)和(75.4±7.8bpm)。 7．在PVN中TRPV4通道的阻斷作用： 將TRPV4拮抗劑RUR100nl（1mmol/L）進(jìn)行腦注射時，所有組的血壓立即升高，并在在4-5分鐘后達(dá)到峰值。RuR的作用持續(xù)約10分鐘。與其他三組相比，DSNS組的血壓變化程度最大(38.8±2.2mmHg，， n=5,P0.05)，SDNS組、SDHS組和DSHS組分別升高為（18.9±2.1mmHg），（14.3±2.1mmHg）和（21.7±2.0mmHg）。心率變化在DSNS組變化最大(143±8.7bpm; n=5, P0.05)，SDNS組、SDHS組及DSHS組分別為（84.8±7.9bpm），（70.5±5.5）和（93.3±6.4bpm）。 結(jié)論： 1.TRPV4通道存在于大鼠下丘腦神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上。 2.高鹽使Dahl’S大鼠下丘腦的TRPV4通道對其激動劑及拮抗劑的反應(yīng)性下降，而SD大鼠則無顯著改變。 3.高鹽使Dahl’S大鼠下丘腦TRPV4通道的蛋白表達(dá)降低，而對SD大鼠無顯著影響。 4.高鹽使Dahl’S大鼠下丘腦TRPV4通道的mRNA表達(dá)降低，而對Dahl’S大鼠無顯著影響。 5.高鹽飲食使PVN中TRPV4的活性下降，破壞了TRPV4通道對血壓的調(diào)控作用，從而導(dǎo)致了Dahl’S大鼠血壓升高。
【圖文】：

第 3 章 研究結(jié)果神經(jīng)元染色結(jié)果 大鼠神經(jīng)元免疫熒光為了證明 TRPV4 通道存在于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上，我們應(yīng)用了 T的特異性抗體、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的特異性抗體 Neun 和 GFAP。（圖 1）：共聚焦顯微鏡下的大鼠下丘腦神經(jīng)元免疫熒光染色結(jié)果：圖下大鼠下丘腦神經(jīng)元；圖 1B 的紅色部分為神經(jīng)元的染色結(jié)果；圖 1 C分為 TRPV4 通道的染色結(jié)果；圖 1D 的黃色部分為 TRPV4 通道和神經(jīng)位后的合成部分。

共聚焦顯微鏡下的大鼠下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)鏡下大鼠下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；B：紅色部分為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)：綠色部分為 TRPV4 通道的染色結(jié)果；D：黃色部分為 TRP細(xì)胞共同定位后的合成部分。鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光染色：共聚焦顯微鏡下的大鼠下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)大鼠下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；圖 2B 的紅色部分為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞C 的綠色部分為 TRPV4 通道的染色結(jié)果；圖 2D 的黃色部分經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞共同定位后的合成部分。免疫熒光染色結(jié)果為證于大鼠下丘腦神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞提供了直接證據(jù)。PV4 激動劑 GSK 對神經(jīng)元動作電位影響
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R544.1

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本文編號：2545108