【摘要】：目的在Islet-1誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞C3H10T1/2向心肌樣細胞定向分化過程中的早期相關(guān)基因啟動子區(qū)甲基化修飾作用探討。方法1.實驗分組:(1)空白對照組(未經(jīng)處理的C3H10T1/2細胞),(2)陰性對照組(感染慢病毒空載體的C3H10T1/2細胞Lv-GFP),(3)高表達Islet-1的C3H10T1/2細胞組,分為1周、2周、3周、4周四個時間點(Islet-1-1W、Islet-1-2W、Islet-1-3W、Islet-1-4W),(4)在過表達Islet-1的C3H10T1/2中加入5-Aza的細胞組,為Islet-1+5-Aza組,(5)在過表達Islet-1的C3H10T1/2中加入BIX01294的細胞組,為Islet-1+BIX01294組。2.實驗方法:熒光倒置相差顯微鏡觀察各組細胞的形態(tài)與綠色熒光,流式細胞術(shù)(Flow CytoMetry,FCM)檢測轉(zhuǎn)染效率,用蛋白印跡法檢測Islet-1蛋白表達,用實時熒光定量PCR檢測Mef2c、GATA4、Nkx2.5的mRNA的時序性表達,用免疫熒光檢測心肌特異蛋白cTnT、CX43的表達,用甲基化特異PCR檢測各組細胞的心肌特異早期基因CPG島的DNA甲基化水平,用染色質(zhì)免疫共沉淀檢測在GATA4、Nkx2.5啟動子區(qū)結(jié)合的組蛋白甲基化水平。結(jié)果1.熒光倒置顯微鏡顯示綠色熒光穩(wěn)定表達;流式細胞檢測islet-1的轉(zhuǎn)染效率為91.7%;westernblot顯示轉(zhuǎn)染islet-1細胞組高表達islet-1蛋白;與空白和陰性對照組相比,islet-1組的細胞形態(tài)呈現(xiàn)出方向均一、短棒狀、排列緊密;免疫熒光結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染islet-1細胞心肌特異性蛋白ctnt在細胞質(zhì)中表達,心肌早期發(fā)育的特異性縫隙連接蛋白cx43在細胞膜上表達;q-pcr檢測心肌特異早期轉(zhuǎn)錄因子nkx2.5、gata4和mef2c的表達逐漸增高,在第三周最明顯(*p0.05),第四周略有降低。2.msp檢測gata4啟動子區(qū)的cpg島的第二個位點(1329bp-1489bp)dna甲基化水平,甲基化水平逐漸降低,在第三周最低(*p0.05);msp檢測nkx2.5啟動子區(qū)cpg島(51bp-219bp)的dna甲基化水平,各組幾乎沒有變化;染色質(zhì)免疫共沉淀(chip)結(jié)果顯示實驗組gata4、nkx2.5基因啟動子區(qū)組蛋白二甲基化水平依次降低,于第3周最低,且實驗組各組均低于空白組和陰性對照組(*p0.05)。3.chip檢測顯示islet-1+5-aza組的gata4啟動子區(qū)組蛋白甲基化水平低于lv-islet-1組(*p0.05);msp檢測顯示islet-1+bix01294組gata4啟動子區(qū)dna甲基化水平低于lv-islet-1組(*p0.05)。結(jié)論1.在誘導(dǎo)mscs心肌分化中,gata4啟動子區(qū)dna甲基化與gata4的表達負(fù)相關(guān),而nkx2.5可能不受dna甲基化調(diào)控。2.在本研究過程中組蛋白h3k9位點的二甲基化水平與gata4、Nkx2.5的表達呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。3.在本研究過程中,心肌早期特異基因GATA4啟動子區(qū)結(jié)合的組蛋白H3K9位點的二甲基化水平和DNA甲基化水平呈現(xiàn)正相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R54

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本文編號：2543841