【摘要】：血管穩(wěn)態(tài)維持是機體生命活動的基礎(chǔ)。血管為機體組織供應(yīng)氧和營養(yǎng)物質(zhì),以及將其產(chǎn)生的代謝廢物排出體外。目前,血管疾病已成為危害人類健康的重要殺手,如何提高血管疾病的診斷及預(yù)防已成為當今人類急切需要解決的社會及科學問題。而這些疾病的病理基礎(chǔ)都是血管結(jié)構(gòu)及血管功能的異常。因此,闡明生理狀態(tài)下血管結(jié)構(gòu)、血管功能的調(diào)控機制以及血管疾病的發(fā)病機制將為血管疾病以及以血管病變?yōu)榛A(chǔ)的其他諸多疾病的預(yù)防與診斷提供理論基礎(chǔ)。盡管目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多重要的相關(guān)基因及相關(guān)的分子機制參與血管疾病的調(diào)控。但還有待更深入的研究,因此發(fā)現(xiàn)血管疾病的調(diào)控基因,為血管疾病的診斷和治療提供新靶標,將有很重要的意義。鎂離子依賴的蛋白磷酸酶1A(Protein phosphatase,magnesium-dependent 1A,PPM1A)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶PPM家族的成員,具有鎂離子或錳離子依賴性的單體磷酸酶。Ppm1a的底物廣泛,能與眾多蛋白結(jié)合使其去磷酸化,從而發(fā)揮作用。轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路參與對血管發(fā)育及血管穩(wěn)態(tài)維持的調(diào)控,并在其中發(fā)揮著重要功能。許多TGF-β信號通路成員,無論是配體Tgfβ1,受體Tgfβr2、Alk1、Alk5等,還是胞內(nèi)信號介導者Smads,其敲除小鼠都表現(xiàn)出嚴重血管發(fā)育缺陷。雖然遺傳修飾小鼠的研究指出TGF-β信號通路的阻斷會導致小鼠在胚胎期血管出現(xiàn)嚴重缺陷。然而TGF-β信號水平被過度激活后,其在血管中的功能研究以及相關(guān)的小鼠模型仍然有所欠缺。根據(jù)以往的文獻報道可知,Ppm1a是TGF-β信號通路的負調(diào)控因子,Ppm1a作為蛋白磷酸酶能使P38去磷酸化抑制TGF-β信號,也能通過去磷酸化Smad2/3抑制TGF-β信號。此外,Ppm1a降低Smad蛋白水平抑制骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)信號。那么,在內(nèi)皮細胞中特異性敲除Ppm1a是否能過度激活TGF-β信號?Ppm1a在血管內(nèi)皮細胞中是否具有功能?本項研究通過對內(nèi)皮細胞特異性敲除的Ppm1a小鼠的表型分析,探索Ppm1a在血管穩(wěn)態(tài)維持中的生理功能以及其分子機制。利用實驗室構(gòu)建的內(nèi)皮細胞特異性的Tie-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與Ppm1a條件基因打靶小鼠交配,獲得內(nèi)皮細胞特異性敲除的Ppm1a小鼠。接下來,我們對內(nèi)皮Ppm1a突變小鼠進行表型分析。通過對突變小鼠的觀察,發(fā)現(xiàn)其能正常出生并存活。并對突變小鼠胚胎期的血管結(jié)構(gòu)進行分析,發(fā)現(xiàn)并無明顯異常。接著,我們對兩月齡的突變小鼠的腦、主動脈、腎、肺等進行組織切片觀察,結(jié)果顯示與對照小鼠相比,成年條件敲除小鼠的血管結(jié)構(gòu)也沒有發(fā)生明顯異常。內(nèi)皮細胞膜結(jié)合粘蛋白Endomucin是一種糖蛋白,被認為是內(nèi)皮細胞的標志物。以往的研究表明,Endomucin主要表達在小鼠胚胎血管內(nèi)皮細胞、成體的靜脈及微血管內(nèi)皮細胞中,在成體主動脈的內(nèi)皮細胞中并不表達。Endomucin具有一些生理功能,如在正常狀態(tài)下,Endomucin能抑制中性粒細胞與內(nèi)皮細胞的粘附,從而維持血管的穩(wěn)態(tài)。而在炎癥狀態(tài)下,Endomucin的低表達能促進中性粒細胞與內(nèi)皮細胞的粘附。通過對成體小鼠的腦、主動脈、腎、肝、心臟、肺等進行Endomucin免疫組化染色,發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮Ppm1a突變小鼠的主動脈內(nèi)皮Endomucin表達顯著增強。我們進一步對不同時間段的突變小鼠進行主動脈內(nèi)膜Endomucin檢測,發(fā)現(xiàn)出生后七天的條件基因敲除小鼠主動脈Endomucin同對照小鼠一樣不表達。而出生一個月以后的突變小鼠,其主動脈內(nèi)膜Endomucin持續(xù)表達。說明內(nèi)皮Ppm1a突變小鼠的主動脈內(nèi)皮細胞Endomucin是獲得性表達。進一步我們利用免疫組化實驗,對TGF-β信號通路中一些重要分子的活化水平進行檢測。我們發(fā)現(xiàn)與對照小鼠相比,條件基因敲除小鼠主動脈內(nèi)膜磷酸化Smad1/5/8的表達上調(diào)。上述結(jié)果提供體內(nèi)證據(jù)表明Ppm1a可以負調(diào)控內(nèi)皮細胞Smad1/5/8的活化。Smad1/5/8活化與Endomucin獲得性表達具有怎樣的相關(guān)性,以及Endomucin的獲得性表達具有怎樣的生理意義尚有待進一步研究。根據(jù)已有的文獻報道可知,TGF-β信號異常激活促進內(nèi)皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。我們進一步檢測了內(nèi)皮Ppm1a敲除小鼠的腎、肺、主動脈、腦等組織是否發(fā)生了內(nèi)皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。通過Masson染色實驗,與對照小鼠相比,內(nèi)皮Ppm1a突變小鼠并沒發(fā)生明顯的纖維化,提示內(nèi)皮Ppm1a突變小鼠無明顯的內(nèi)皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生。此外,我們對敲除小鼠進行低氧低壓應(yīng)激誘導處理,與上述結(jié)果一致,經(jīng)低氧低壓處理的突變小鼠也無內(nèi)皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生。血腦屏障作為腦血管特化屏障結(jié)構(gòu),能夠精確控制中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周血中各種物質(zhì)的進出,從而保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境的高度穩(wěn)定,對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常生理狀態(tài)具有重要的生物學意義。TGF-β信號通路在血腦屏障的成熟過程中發(fā)揮著重要作用。我們檢測了正常情況下內(nèi)皮細胞Ppm1a突變小鼠血腦屏障是否發(fā)生滲漏,與對照小鼠相比,突變小鼠在正常下并無血腦屏障的滲漏。而根據(jù)以往的文獻報道可知,缺氧是眾多腦血管疾病的根源,其主要是影響腦組織的血腦屏障。因此,我們也檢測了在低氧低壓應(yīng)激誘導處理后的內(nèi)皮Ppm1a敲除小鼠血腦屏障的滲漏情況,發(fā)現(xiàn)低氧低壓應(yīng)激誘導處理后內(nèi)皮Ppm1a突變小鼠的血腦屏障完整性與對照小鼠相比并無明顯異常。綜上所述,小鼠血管內(nèi)皮細胞中敲除Ppm1a,對成體重要器官包括腦、腎、肝、心臟等的血管結(jié)構(gòu)無顯著影響。但能使主動脈中內(nèi)皮細胞Endomucin獲得性表達,主動脈內(nèi)皮細胞磷酸化Smad1/5/8表達上調(diào)。本研究首次系統(tǒng)闡述內(nèi)皮細胞Ppm1a在血管發(fā)育和穩(wěn)態(tài)維持中的生理功能,為血管發(fā)育與穩(wěn)態(tài)維持機制的新認識提供遺傳學依據(jù)。轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路與Notch信號通路在血管發(fā)育以及血管疾病的發(fā)生過程中起重要作用。在內(nèi)皮細胞中,TGF-β信號通路與Notch信號通路的相互作用已被報道。此外,以往的研究發(fā)現(xiàn)在腦血管內(nèi)皮細胞中通過TGF-β/Smad4與Notch信號通路的協(xié)同作用來維持血管的完整。之前,我們發(fā)現(xiàn)在Smad4缺損的內(nèi)皮細胞中,Notch信號明顯下調(diào)。然而,Notch受體是否作為TGF-β/Smad4信號通路下游靶分子而被TGF-β/Smad4直接調(diào)節(jié),至今未見報道。在本項研究中,我們發(fā)現(xiàn)TGF-β1和骨形成蛋白4(Bone morphogenetic protein 4,BMP4)的刺激能在轉(zhuǎn)錄水平上促進Notch1和Notch4的表達。在敲低Smad4或者Notch4基因啟動子Smad結(jié)合位點突變的情況下,Notch4的表達失去對TGF-β1和BMP4的反應(yīng)性。綜上所述,腦血管內(nèi)皮細胞中Smad4介導的TGF-β/BMP信號直接上調(diào)Notch受體表達。
【圖文】：

12圖1-2 新血管出芽形成示意圖[2]多種信號通路和調(diào)節(jié)分子共同調(diào)節(jié)著血管發(fā)育的各個階段，如VEGF、Notch、Angiopoietin/Tie-2、PDGFB、TGF-β等。VEGF在血管形成中作用非常廣泛。哺乳動物有5鐘VEGF，其中VEGF-A是調(diào)控血管形成的主要類型。早期多次利用基因敲除小鼠的研究證明，VEGF-A雜合性缺失就會因單倍劑量不足造成小鼠心血管系統(tǒng)發(fā)育障礙而死于胚胎早期。VEGF通過其特異性受體VEGFR1-3發(fā)揮作用，調(diào)控內(nèi)皮細胞的增殖、遷移以及內(nèi)皮祖細胞的募集。在血管發(fā)生過程中，Notch信號通路通過調(diào)控Ephrin-B2和EphB4的表達，進而調(diào)控動脈-靜脈分化。在頂細胞出芽過程中，Notch信號與VEGF信號被認為是調(diào)控血管出芽和生長的基本信號通路。在血管壁成熟過程中

質(zhì)的分泌等。當 TGF-β 信號通路中的組分受損時，將會導致許多人類疾病的發(fā)生，，如組織纖維化，癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移等[6-9]。TGF-β 信號通路通過其配體與細胞表面的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（稱為 II 型和 I 型）受體結(jié)合，進而將信號傳導給胞內(nèi)介導者。當配體結(jié)合 II 型受體時，磷酸化特定的 I 型受體，形成異四聚體復合物，進而磷酸化及激活 SMAD 轉(zhuǎn)錄因子（通常稱為受體調(diào)節(jié)的 SMAD 或R-SMAD）[10-12]。R-SMADs 作為 TGFβR1 激酶的底物被磷酸化后與 Co-SMAD結(jié)合形成復合物，再進入核內(nèi)調(diào)節(jié)特定基因的表達，在核內(nèi)其調(diào)控眾多TGFβ/BMP 靶基因的轉(zhuǎn)錄。TGF-β 超家族的配體根據(jù)它們激活特定 SMAD 轉(zhuǎn)錄因子的能力，可廣泛地分為兩種。TGF-β 亞家族（包括 TGFβ，Acticvin 和 Nodal）激活SMAD2、SMAD3，而BMP亞家族（包括BMPs，GDFs和AMH）激活SMAD1SMAD5、SMAD8。TGF-β 亞家族的配體特異性結(jié)合 II 型受體（TGFβR-II 或TGFβR-ActR-IIB）和 I 型受體（ALK4，ALK5 或 ALK7），而 BMP 亞家族的配體特異性結(jié)合II型受體（BMPR-II或 ActR-IIA/B或AMHR-II）和I型受體（ALK1ALK2，ALK3 或 ALK6）。不同的配體結(jié)合不同的受體，從而介導不同的信號通路發(fā)生不同的反應(yīng)[13]。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R543

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Effect of TGF-β/Smad signaling pathway on lung myofibroblast differentiation[J];Acta Pharmacologica Sinica;2007年03期

本文編號：2543598