【摘要】：研究背景隨著社會環(huán)境和飲食結(jié)構(gòu)的變化,發(fā)病率和死亡率在心血管系統(tǒng)疾病中出現(xiàn)逐年上升趨勢,而且發(fā)病年齡越來越年輕,特別是冠心病(Coronary Heart Disease,CHD)、急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction,AMI)和心力衰竭(Cardiac Failure,CHF)等是心血管疾病發(fā)病率和死亡率增加的主要原因,也是心臟源性猝死的主要病因之一[1]。在發(fā)達國家死亡原因最常見的是冠心病[2]。WHO全球統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示由冠心病和循環(huán)系統(tǒng)疾病導致的死亡從1999年至2010年已經(jīng)上升了1/3,而在2015年每死亡3個人中就有一個是由于冠心病[3],因此預防和治療冠心病成為人類迫切解決的問題。Sirt1近似同種類的酵母沉默信息調(diào)節(jié)因子2(Silent Information Regulator-2,Sir2),是依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide,NAD)脫乙酰蛋白酶。Sirtuins有7個家族成員即Sirt1~Sirt7,但是Sirt1一直是被廣泛研究的sirtuin蛋白[4]。Sirt1在大腦、心臟、肝臟、胰腺、骨骼肌、脾臟和脂肪組織等身體器官中表達,它存在于細胞核和細胞質(zhì)中但主要是在細胞核中表達[2]。Sirt1調(diào)節(jié)的脫乙�；饔脤τ谠S多蛋白質(zhì)的活性具有重要的作用,調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯,蛋白質(zhì)的翻譯在許多生物功能中具有重要的功能,如氧化應激、新陳代謝、細胞增殖和基因組的穩(wěn)定性[5]。此外,Sirt1一直與老化、代謝疾病、神經(jīng)退化性疾病、癌癥和心血管疾病有關(guān)[6]。磷脂酰肌醇-蘇氨酸蛋白激酶(Phosphatidyl Inositol 3-kinase/Serine-threomine kinase,PI3k-Akt)信號通路不僅在癌癥中具有重要的作用,而且在正常細胞中也具有重要的作用。這條通路在細胞的許多生物學功能中具有重要的作用,如增殖、粘附、遷移、侵入、代謝和存活等[7]�；谏鲜銮闆r,根據(jù)目前國內(nèi)外有關(guān)的研究進展我們提出以下問題:白藜蘆醇能否促進Sirt1的表達,并在缺血灌注損傷中保護心肌細胞?Sirt1是否通過上調(diào)PI3k-Akt信號通路起到保護心肌細胞的作用呢?研究目標1.觀測在缺血再灌注損傷過程中Sirt1是否對心肌細胞有保護作用。2.探討Sirt1對PI3k-Akt信號通路的影響,明確Sirt1心臟保護作用的發(fā)生機制。研究方法1.心肌細胞系(H9c2)隨機分為對照組(Control組)和缺氧復氧組(H/R),其中缺氧復氧組分為3組,一組給予含25μM白藜蘆醇培養(yǎng)基培養(yǎng),一組給予含1μM EX527和25μM白藜蘆醇培養(yǎng)基,最后一組給予正常培養(yǎng)基,培養(yǎng)2 d-3 d后進行缺氧復氧干預,對照組不做任何處理。2.應用TUNEL免疫熒光染色法,在熒光顯微鏡下觀察各組H9c2心肌細胞系細胞凋亡情況并計算凋亡率。3.應用DHE免疫熒光染色法在熒光顯微鏡下觀察各組心肌細胞的活性氧水平,并計算活性氧比率。4.應用MTT比色法,檢測各組心肌細胞的細胞活性。5.采用JC-1免疫熒光染色法,檢測各組心肌細胞中線粒體的膜電位,并計算紅光與綠光的比值。6.應用抗體免疫熒光檢測Sirt1在心肌細胞核中的表達情況。7.采用Western Blotting免疫印跡法檢測各組心肌細胞中Sirt1和p-Akt表達情況。8.采用Western Blotting免疫印跡法檢測加入Akt特異性抑制劑LY294002后,心肌細胞中Sirt1和p-Akt蛋白的表達水平。研究結(jié)果1.與對照組(0.240±0.007)相比,缺氧復氧組(0.487±0.013)凋亡率顯著上升(P0.001);與缺氧復氧組(0.487±0.013)相比,加入Sirt1激動劑白藜蘆醇預處理組(0.255±0.010)凋亡率顯著降低(P0.001),而Sirt1抑制劑組(0.569±0.010)凋亡率最高(P0.001)。2.與對照組(0.222±0.004)相比,缺氧復氧組(0.372±0.020)細胞活性氧水平顯著上升(P0.001),與缺氧復氧組(0.372±0.020)相比,白藜蘆醇預處理組(0.256±0.026)活性氧水平顯著降低(P0.001),而EX527組(0.593±0.018)細胞活性氧顯著上升(P0.001)。3.與對照組(0.778±0.007)相比,缺氧復氧組(0.455±0.002)細胞活性顯著降低(P0.001)缺氧復氧組(0.455±0.002)相比,白藜蘆醇組(0.587±0.005)細胞活性水平顯著上升(P0.001),EX527組(0.240±0.009)細胞活性水平最低(P0.001)。4.與對照組(3.822±0.007)相比,缺氧復氧組(2.579±0.006)線粒體膜電位水平顯著降低(P0.001),與缺氧復氧組(2.579±0.006)相比,白藜蘆醇組(3.904±0.042)線粒體膜電位顯著上升(P0.001),而EX527組(1.517±0.037)線粒體膜單位水平最低(P0.001)。5.與對照組(0.333±0.026)相比,白藜蘆醇組(0.574±0.018)中Sirt1在細胞核的表達也顯著增加(P0.001)。6.對照組中Sirt和p-Akt相對灰度值分別為(1.697±0.020)和(0.0137±0.0005);缺氧復氧組分別為(2.141±0.015)和(0.0156±0.0004);與對照組相比,缺氧復氧組中Sirt1的表達水平顯著降低(P0.001),而p-Akt蛋白的表達無顯著性差異。白藜蘆醇組相對灰度值為(3.434±0.010)和(0.0227±0.0009),與缺氧復氧組(2.141±0.015)和(0.0156±0.0004)相比,Sirt1和p-Akt蛋白表達顯著上升(P0.001);EX527組蛋白灰度值為(1.530±0.030)和(0.0120±0.0004),與缺氧復氧組相比Sirt1和p-Akt蛋白的表達水平顯著降低(P0.001)。7.LY294002可以抑制Akt蛋白的表達水平,對照組中p-Akt蛋白的相對灰度值為(2.353±0.059),加入LY294002后p-Akt蛋白的相對灰度值為(1.548±0.021),兩組相比具有顯著的差異(P0.001)。加入LY294002后Sirt1蛋白的表達也顯著降低,對照組中Sirt1蛋白的相對灰度值為(2.355±0.262),而加入LY294002后Sirt1蛋白的相對灰度值為(1.214±0.151),兩組相比具有高度顯著差異(P0.001)。研究結(jié)論1.缺氧復氧能成功模擬心肌梗死缺血再灌注損傷心肌細胞系H9c2細胞凋亡率顯著上升。2.Sirt1能夠減輕H9c2細胞在缺血再灌注中的損傷,其中PI3k-Akt信號通路在Sirt1減輕H9c2缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用。3.該研究為預防和治療CHD提供新的靶點及重要的理論基礎。
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圖片說明： -18-圖 1：Sirt1 在肝臟、肌肉、心臟和脂肪中的功能 ( Kahlilia C Morris,,et al. 2011,）2.2 Sirt1 與肝臟組織眾所周知，體內(nèi)葡萄糖穩(wěn)態(tài)的最關(guān)鍵調(diào)節(jié)來自于肝臟，當血液中葡萄糖因為禁食等處于低水平狀態(tài)時，肝臟代謝會迅速轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟欠纸�，發(fā)生糖異生從而保障葡萄糖的供應，體內(nèi)產(chǎn)生的酮體也會發(fā)生相應的反應補充葡萄糖的缺乏。禁食會激活肝臟中的脂肪組織（WhiteAdipose Tissue ，WAT）發(fā)生脂肪酸氧化，一些轉(zhuǎn)錄因子參與這些復雜的轉(zhuǎn)化從而使機體適應能量缺乏，禁食時 Sirt1 調(diào)節(jié)代謝轉(zhuǎn)化[84]，在初始階段（葡萄糖未分解階段）胰島 細胞產(chǎn)生胰高血糖素通過 cAMP反應結(jié)合蛋白（cAMP Response Element Binding Protein ，CREB）與它的共激活劑
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圖片說明： 第四軍醫(yī)大學碩士學位論文再灌注損傷[118]。同樣，，患有鐮狀細胞貧血的病人也遭受了很有特色的血管閉塞和后續(xù)再灌注的痛苦，這種反應類似于缺血再灌注[119]。要指出的是缺血性癥狀是在缺血條件下多種器官癥狀的組合，盡管這些癥狀有著相似的生物應答反應，但是不同系統(tǒng)灌注減少相對于缺血再灌注器官損傷的單一區(qū)域相比其影響也具有很大的差別[117]。事實上多種病理過程參與組織的缺血再灌注損傷（圖 2），比如出現(xiàn)在缺血過程中低氧導致腺苷酸環(huán)化酶活性和細胞內(nèi) cAMP 水平降低伴隨著血管通透性增加，使得內(nèi)皮細胞的屏障功能受損。此外，缺血再灌注激活了包括凋亡和與自噬有關(guān)的細胞死亡及壞死[120]。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R54


本文編號：2513275