【摘要】：目的利用腹腔注射異丙腎上腺素(isoprenaline,ISO)在野生型C57BL/6(wild type,WT)和TLR4基因敲除(toll-like receptor 4 knockout,TLR4-/-)兩種小鼠體內(nèi)構(gòu)建心肌缺血模型:(1)觀(guān)察心肌缺血時(shí),兩種小鼠體內(nèi)高遷移率蛋白B1(high mobility protein B1,HMGB1)以及Toll樣受體4(TLR4)表達(dá)水平是否升高;(2)TLR4基因敲除是否對(duì)ISO誘導(dǎo)的心肌缺血有一定抑制作用;(3)探討HMGB1-TLR4信號(hào)通路是否在心肌缺血損傷中起到重要作用,HMGB1是否通過(guò)TLR4途徑影響心肌缺血所導(dǎo)致的的免疫炎癥反應(yīng),為今后更深入研究提供更多的理論基礎(chǔ)。方法8周齡大小的C57BL/6野生型小鼠和TLR4基因敲除小鼠腹腔注射異丙腎上腺素20mg/kg/只持續(xù)注射7天,構(gòu)建心肌缺血模型,從病理水平、心功能以及整體狀態(tài)證實(shí)造模成功,兩種實(shí)驗(yàn)小鼠各分為5組:1、野生型C57BL/6小鼠:(1)空白對(duì)照組(WT-Control組);(2)生理鹽水組(WT-Saline組):實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每天腹腔注射生理鹽水20mg/kg/天;(3)心肌缺血組(WT-ISO組):腹腔注射ISO20mg/kg/只,連續(xù)注射7天至造模成功;(4)重組HMGB1預(yù)處理組(WT-rHMGB1-ISO組):于造模前兩天腹腔注射重組HMGB1 10μg/只連續(xù)注射2天;(5)HMGB1阻斷組(WT-ISO-Anti-HMGB1組):于造模結(jié)束后腹腔注射抗HMGB1抗體400μg/只;2、TLR4基因敲除小鼠:(1)空白對(duì)照組(TLR4-/--Control組);(2)生理鹽水組(TLR4-/--Saline組):實(shí)驗(yàn)中每天腹腔注射生理鹽水20mg/kg/天;(3)心肌缺血組(TLR4-/--ISO組):腹腔注射ISO 20mg/kg/只,連續(xù)注射7天至造模成功;(4)重組HMGB1預(yù)處理組(TLR4-/--rHMGB1-ISO組):于造模前兩天腹腔注射重組HMGB1 10μg/只連續(xù)注射2天;(5)HMGB1阻斷組(TLR4-/--ISO-Anti-HMGB1組):于造模結(jié)束后腹腔注射抗HMGB1抗體400μg/只。用免疫蛋白印跡法(Western Blotting)方法檢測(cè)心肌組織HMGB1、TLR4的蛋白水平,利用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)(Real time PCR)方法檢測(cè)心肌組織HMGB1、TLR4、TNF-α、IL-6的RNA表達(dá)水平。結(jié)果(1)心肌缺血時(shí)小鼠心肌組織中HMGB1的改變:Western Blot檢測(cè)各組小鼠心肌組織中HMGB1蛋白表達(dá)水平,RT-PCR檢測(cè)各組小鼠心肌組織中HMGB1的mRNA表達(dá),免疫組化檢測(cè)小鼠心肌組織中HMGB1的水平,在兩種小鼠中與空白對(duì)照組相比,ISO組和rHMGB1組HMGB1蛋白水平和RNA水平均升高(P0.05),Anti-HMGB1組HMGB1蛋白水平和RNA水平較ISO組降低(P0.05),結(jié)果顯示HMGB1在ISO誘導(dǎo)的心肌缺血損傷中起到重要作用;(2)心肌急性缺血時(shí)心肌組織中TLR4的變化:在野生型小鼠中,Western Blot檢測(cè)各組小鼠心肌組織中TLR4蛋白表達(dá)水平,RT-PCR檢測(cè)各組小鼠心肌組織中TLR4的mRNA表達(dá),免疫組化檢測(cè)小鼠心肌組織中TLR4的水平,與空白對(duì)照組相比,WT-ISO組TLR4的蛋白和RNA表達(dá)明顯增高(P0.01),同時(shí)相較于WT-ISO組,WT-rHMGB1組TLR4的蛋白和RNA表達(dá)有所增高,WT-ISO-Anti-HMGB1組TLR4水平下降(P0.05),說(shuō)明HMGB1可能部分通過(guò)與其受體TLR4結(jié)合進(jìn)一步介導(dǎo)心肌缺血性損傷;(3)TLR4基因敲除對(duì)HMGB1-TLR4通路的影響:RT-PCR檢測(cè)各組小鼠心肌組織中TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá),在野生型C57BL6小鼠中,與WT-Control相比,WT-ISO,WT-rHMGB1-ISO組IL-6及TNF-αRNA表達(dá)明顯升高(P0.01),WT-ISO-Anti-HMGB1組IL-6和TNF-αRNA表達(dá)明顯低于WT-ISO組(P0.05),在TLR4基因敲除小鼠中,造模后小鼠TNF-α和IL-6的水平并沒(méi)有明顯變化,說(shuō)明TLR4基因敲除部分阻斷由ISO誘導(dǎo)的小鼠心肌急性缺血損傷。結(jié)論心肌缺血時(shí),HMGB1作為一種晚期炎癥因子有明顯升高,其機(jī)制可能主要為當(dāng)心肌缺血時(shí),HMGB1從細(xì)胞核內(nèi)釋放出來(lái),與其受體TLR4結(jié)合,進(jìn)一步促進(jìn)下游通路的炎癥因子的釋放最終加重心肌損傷,起到促炎效應(yīng)。
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【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R54

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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本文編號(hào)：2503352