【摘要】：目的利用腹腔注射異丙腎上腺素(isoprenaline,ISO)在野生型C57BL/6(wild type,WT)和TLR4基因敲除(toll-like receptor 4 knockout,TLR4-/-)兩種小鼠體內(nèi)構(gòu)建心肌缺血模型:(1)觀察心肌缺血時,兩種小鼠體內(nèi)高遷移率蛋白B1(high mobility protein B1,HMGB1)以及Toll樣受體4(TLR4)表達水平是否升高;(2)TLR4基因敲除是否對ISO誘導(dǎo)的心肌缺血有一定抑制作用;(3)探討HMGB1-TLR4信號通路是否在心肌缺血損傷中起到重要作用,HMGB1是否通過TLR4途徑影響心肌缺血所導(dǎo)致的的免疫炎癥反應(yīng),為今后更深入研究提供更多的理論基礎(chǔ)。方法8周齡大小的C57BL/6野生型小鼠和TLR4基因敲除小鼠腹腔注射異丙腎上腺素20mg/kg/只持續(xù)注射7天,構(gòu)建心肌缺血模型,從病理水平、心功能以及整體狀態(tài)證實造模成功,兩種實驗小鼠各分為5組:1、野生型C57BL/6小鼠:(1)空白對照組(WT-Control組);(2)生理鹽水組(WT-Saline組):實驗過程中每天腹腔注射生理鹽水20mg/kg/天;(3)心肌缺血組(WT-ISO組):腹腔注射ISO20mg/kg/只,連續(xù)注射7天至造模成功;(4)重組HMGB1預(yù)處理組(WT-rHMGB1-ISO組):于造模前兩天腹腔注射重組HMGB1 10μg/只連續(xù)注射2天;(5)HMGB1阻斷組(WT-ISO-Anti-HMGB1組):于造模結(jié)束后腹腔注射抗HMGB1抗體400μg/只;2、TLR4基因敲除小鼠:(1)空白對照組(TLR4-/--Control組);(2)生理鹽水組(TLR4-/--Saline組):實驗中每天腹腔注射生理鹽水20mg/kg/天;(3)心肌缺血組(TLR4-/--ISO組):腹腔注射ISO 20mg/kg/只,連續(xù)注射7天至造模成功;(4)重組HMGB1預(yù)處理組(TLR4-/--rHMGB1-ISO組):于造模前兩天腹腔注射重組HMGB1 10μg/只連續(xù)注射2天;(5)HMGB1阻斷組(TLR4-/--ISO-Anti-HMGB1組):于造模結(jié)束后腹腔注射抗HMGB1抗體400μg/只。用免疫蛋白印跡法(Western Blotting)方法檢測心肌組織HMGB1、TLR4的蛋白水平,利用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)(Real time PCR)方法檢測心肌組織HMGB1、TLR4、TNF-α、IL-6的RNA表達水平。結(jié)果(1)心肌缺血時小鼠心肌組織中HMGB1的改變:Western Blot檢測各組小鼠心肌組織中HMGB1蛋白表達水平,RT-PCR檢測各組小鼠心肌組織中HMGB1的mRNA表達,免疫組化檢測小鼠心肌組織中HMGB1的水平,在兩種小鼠中與空白對照組相比,ISO組和rHMGB1組HMGB1蛋白水平和RNA水平均升高(P0.05),Anti-HMGB1組HMGB1蛋白水平和RNA水平較ISO組降低(P0.05),結(jié)果顯示HMGB1在ISO誘導(dǎo)的心肌缺血損傷中起到重要作用;(2)心肌急性缺血時心肌組織中TLR4的變化:在野生型小鼠中,Western Blot檢測各組小鼠心肌組織中TLR4蛋白表達水平,RT-PCR檢測各組小鼠心肌組織中TLR4的mRNA表達,免疫組化檢測小鼠心肌組織中TLR4的水平,與空白對照組相比,WT-ISO組TLR4的蛋白和RNA表達明顯增高(P0.01),同時相較于WT-ISO組,WT-rHMGB1組TLR4的蛋白和RNA表達有所增高,WT-ISO-Anti-HMGB1組TLR4水平下降(P0.05),說明HMGB1可能部分通過與其受體TLR4結(jié)合進一步介導(dǎo)心肌缺血性損傷;(3)TLR4基因敲除對HMGB1-TLR4通路的影響:RT-PCR檢測各組小鼠心肌組織中TNF-α和IL-6的mRNA表達,在野生型C57BL6小鼠中,與WT-Control相比,WT-ISO,WT-rHMGB1-ISO組IL-6及TNF-αRNA表達明顯升高(P0.01),WT-ISO-Anti-HMGB1組IL-6和TNF-αRNA表達明顯低于WT-ISO組(P0.05),在TLR4基因敲除小鼠中,造模后小鼠TNF-α和IL-6的水平并沒有明顯變化,說明TLR4基因敲除部分阻斷由ISO誘導(dǎo)的小鼠心肌急性缺血損傷。結(jié)論心肌缺血時,HMGB1作為一種晚期炎癥因子有明顯升高,其機制可能主要為當心肌缺血時,HMGB1從細胞核內(nèi)釋放出來,與其受體TLR4結(jié)合,進一步促進下游通路的炎癥因子的釋放最終加重心肌損傷,起到促炎效應(yīng)。
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【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R54

【參考文獻】

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本文編號：2503352