本文關(guān)鍵詞：復(fù)方心可舒治療冠心病多靶點作用的分子對接，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

　　[摘要] 濕乃萬病之源，濕邪易引起疾病、促進衰老，衰老也會促進疾病的發(fā)生發(fā)展。該文探討濕邪與衰老的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)祛濕中藥中抗衰老的活性成分，對祛濕藥的抗衰老作用進行機制解析。該文通過分子對接技術(shù)，以與衰老相關(guān)的雷帕霉素靶蛋白為對接受體，以茯苓、桑枝、木瓜、薏苡仁和厚樸5味祛濕藥中的化學成分為對接小分子，初步篩選祛濕藥中的抗衰老活性成分。與已上市雷帕霉素抑制劑坦西莫司及依維莫司對比，分析得到12種潛在的抗衰老的活性成分，這些成分的成藥性有待進一步考察。分子對接結(jié)果表明祛濕藥中多種成分可以通過作用于雷帕霉素靶蛋白而發(fā)揮抗衰老的活性，該結(jié)果為從濕論治延緩衰老提供了新的思路和方向。
　　[關(guān)鍵詞] 抗衰老；祛濕藥；濕邪；分子對接
　　[Abstract] Dampness evil is the source of all diseases， which is easy to cause disease and promote aging， while aging could also promote the occurence and development of diseases. In this paper， the relationship between the dampness evil and aging would be discussed， to find the anti-aging active ingredients in traditional Chinese medicine （TCM）， and analyze the anti-aging mechanism of dampness eliminating drug. Molecular docking technology was used， with aging-related mammalian target of rapamycin as the docking receptors， and chemical components of Fuling， Sangzhi， Mugua， Yiyiren and Houpo as the docking molecules， to preliminarily screen the anti-aging active ingredients in dampness eliminating drug. Through the comparison with active drugs already on the market （temsirolimus and everolimus）， 12 kinds of potential anti-aging active ingredients were found， but their drug gability still needs further study. The docking results showed that various components in the dampness eliminating drug can play anti-aging activities by acting on mammalian target of rapamycin. This result provides a new thought and direction for the method of delaying aging by eliminating dampness.
　　[Key words] anti-aging；drugs of eliminating dampness；dampness evil；molecular docking
　　doi：10.4268/cjcmm20161325
　　濕邪是中醫(yī)病因?qū)W說獨有的概念，具有4個特征：濕性重濁；濕為陰邪，易阻遏氣機，損傷陽氣；濕性黏滯；濕性趨下，易襲陰位[1]。現(xiàn)代生活中冠心病、糖尿病、類風濕關(guān)節(jié)炎、高血壓等危害公眾健康的幾種重大疾病均與濕邪有關(guān)。
　　冠心病心絞痛屬于中醫(yī)胸痹范疇，，近年來隨著對冠心病認識的加深，痰瘀論在冠心病的治療上得到了廣泛認可。冠心病常見的病理過程就是由濕生痰，由痰致瘀，因此對冠心病從濕論治，在痰瘀形成之前，對濕邪進行干預(yù)，能起到既病防變的良好效果[2]。根據(jù)中醫(yī)“治未病”的理論，現(xiàn)代中醫(yī)治療冠心病就應(yīng)該從濕論治[3]。
　　糖尿病屬于中醫(yī)消渴的范疇，近年來，有關(guān)糖尿病的辨證論治研究的不斷深入，尤其從濕熱論治糖尿病成為該研究領(lǐng)域的熱點�，F(xiàn)代中醫(yī)學家普遍認為，濕熱證在糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中不可忽視[4]。當“脾失運化”，體內(nèi)的濕邪就會停留、積聚，日久就會發(fā)熱，由濕邪轉(zhuǎn)化為濕熱之邪。濕熱內(nèi)蘊，困阻胰臟，胰島細胞萎縮、功能減退，不能正常按需分泌胰島素，不能把血糖穩(wěn)定在正常范圍內(nèi)，血糖升高，從而引起糖尿病發(fā)[5]。
　　類風濕關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)痹癥，有醫(yī)家認為，患者無論寒熱虛實，均與濕邪有關(guān)[6]，在疾病早期，痰瘀尚未形成，但痰濁的早期即為濕邪，濕性重濁粘滯，濕邪為患日久可轉(zhuǎn)化為痰濁；而瘀血的早期則為血運失調(diào)，血行不暢日久則轉(zhuǎn)化為瘀血，痰瘀膠結(jié)，病程纏綿反復(fù)。故而在本病的早期應(yīng)注意預(yù)防痰瘀的形成[7]，濕邪入體可能引起機體免疫功能的障礙[8]。
　　阿爾茨海默癥在中醫(yī)認識中，屬于“呆病、健忘、虛勞、善忘”等范疇，病因分為實證和虛證，屬實者則多為水蘊內(nèi)停，濕聚生痰，上蒙清竅所致[9]。水濕不化，痰濁始生，則會對認知能力產(chǎn)生影響[10]。
　　由此可見，濕邪是引起疾病的多種因素之本。而衰老是一個積累有害物質(zhì)、導(dǎo)致重要功能喪失和有機體生理狀況惡化的過程，最終也會導(dǎo)致疾病與死亡[11]。與衰老相關(guān)的疾病有神經(jīng)退行性疾病阿爾茨海默癥、帕金森等，代謝綜合征肥胖、糖尿病、冠心病、腎功能受損等，年齡相關(guān)性眼病白內(nèi)障，黃斑病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變等，腫瘤乳腺癌、腎細胞癌等，免疫系統(tǒng)疾病移植后排斥反應(yīng)、自身免疫性疾病，退行性骨關(guān)節(jié)炎等[12]。張宇享[13]在分析內(nèi)經(jīng)中論述的衰老機制時指出關(guān)于衰老的濕邪瘀阻說，認為濕邪入侵會嚴重損害身體健康，耗散衛(wèi)氣，阻閉氣血輸送轉(zhuǎn)運，影響機體代謝，引起諸多病變，最終導(dǎo)致陽氣漸虛，陰邪漸增，脈絡(luò)阻滯，疾病產(chǎn)生，促進衰老。因此從祛濕的角度出發(fā)不僅能夠輔助治療與濕邪相關(guān)的疾病，同時能夠達到延緩衰老的目的。 　　已報道的抗衰老信號通路主要是胰島素/胰島素樣生長因子1信號通路（IIS）、TOR信號通路、AMPK信號通路、Sirtuins通路[14]。報道較多且研究較清楚的mTOR信號通路，研究表明，多種疾�。ㄈ绨┌Y、糖尿病、心血管疾病及神經(jīng)功能紊亂等）與mTOR信號通路失調(diào)有關(guān)[15]。mTOR信號通路異�；钴S會引起這些疾病，這就使mTOR抑制劑產(chǎn)生巨大的潛在應(yīng)用價值[16]。傳統(tǒng)的mTOR抑制劑是雷帕霉素及其衍生物[17]。雷帕霉素與細胞中的受體FKBP12（FK506結(jié)合蛋白12）結(jié)合形成FKBP12-雷帕霉素復(fù)合物再與mTOR靶蛋白的FRB區(qū)域相結(jié)合，抑制mTOR的激酶活性，從而阻斷mTOR信號通路的傳導(dǎo)[18]，從而達到抗衰老的目的。但是雷帕霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯類化合物，存在生物利用度差、水溶性差的缺點。因此，尋找更多的生物利用度高，水溶性好的抗衰老藥物具有現(xiàn)實意義。通過雷帕霉素抑制mTOR靶蛋白的原理可知，小分子與FKBP12結(jié)合即可以抑制mTOR信號通路的傳導(dǎo)[19]。
　　筆者選取祛濕藥中茯苓[20]、桑枝[21]、木瓜[22]、薏苡仁[23]、厚樸[24]為研究對象，這5味中藥均有報道證明其具有抗衰老的活性。因此，本研究旨在采用分子對接方法，以mTOR靶蛋白為對接受體，以5味祛濕藥的化學成分為對接小分子，快速篩選祛濕中藥中抗衰老的活性成分，對祛濕中藥抗衰老的有效成分和作用機制進行研究。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料來源
　　通過整理匯總中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫提供的近3年的文獻數(shù)據(jù)，找出祛濕藥中具有抗衰老作用的中藥主要是茯苓、桑枝、木瓜、薏苡仁、厚樸，5味藥在《中國藥典》均有收載。
　　1.2 抗衰老靶點的選擇及結(jié)構(gòu)準備
　　本研究以雷帕霉素靶蛋白為分子對接的受體，靶蛋白三維結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫PDB中搜索，選擇了PDB代碼為1NSG的蛋白質(zhì)（復(fù)合了雷帕霉素的靶蛋白）結(jié)構(gòu)文件作為分子對接研究的載體。利用Discovery Studio 4.0對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行處理，進行刪去配體小分子和水分子及多余構(gòu)象、加氫后，最后保留蛋白質(zhì)A鏈用于分子對接。
　　1.3 中藥小分子的數(shù)據(jù)庫準備
　　以已經(jīng)確定的5味中藥的化學成分構(gòu)建中藥小分子數(shù)據(jù)庫。在TCMD數(shù)據(jù)庫中收錄5味中藥分別包含的化學成分，其中茯苓的化學成分34個，桑枝的化學成分23個，木瓜的化學成分80個，薏苡仁的化學成分38個，厚樸的化學成分139個。將所有小分子保存為mol2格式文件，用于后續(xù)的分子對接。
　　1.4 分子對接
　　1.4.1 靶點活性口袋的確定 將1NSG蛋白質(zhì)與雷帕霉素發(fā)生相互作用的部位初步定為活性口袋，利用CDOCKER工具將雷帕霉素對接到原蛋白的活性口袋，根據(jù)配體對接構(gòu)象與晶體結(jié)構(gòu)中配體之間的均方根偏差（RMSD）的大小判斷對接程序參數(shù)設(shè)置的合理性及對該晶體復(fù)合物的適用性，RMSD值越小，對接效果越好[25-26]。認為RMSD<2.0時能夠較好的重現(xiàn)原配體-受體結(jié)合模式。本文通過調(diào)整活性口袋的大小及坐標使得RMSD值達到要求，記錄此時活性口袋的信息及-Cdocker interaction energy和-Cdocker energy。
　　1.4.2 各靶點與已上市藥物、中藥小分子的對接 利用Cocker工具將各靶點與其已上市藥物、中藥小分子對接，參數(shù)及活性口袋設(shè)置均參照1.4.1項的記錄結(jié)果。在DrugBank數(shù)據(jù)庫中以靶點名稱為關(guān)鍵詞搜索并下載已上市藥物，包括mTOR靶蛋白抑制劑2個：坦西莫司（temsirolimus）、依維莫司（everolimus）。分別將其與設(shè)置好參數(shù)的活性口袋對接，用Analyze Ligands Pose模塊分析對接過程中靶點與活性藥物分子相互作用的關(guān)鍵氨基酸，為建立篩選規(guī)則、分析化合物與靶點相互作用的合理性提供依據(jù)。中藥小分子數(shù)據(jù)庫與各靶點對接計算完成后，對于同一靶點，將對接成功的構(gòu)象按-Cdocker interaction energy和-Cdocker energy為評價指標，以1.4.1項中所記錄值的80%作為閾值，尋找打分值高于閾值的化合物，若此化合物與靶點相互作用方式與已上市藥物的作用方式接近，則認為是作用于靶點的活性化合物。
　　2 結(jié)果與分析
　　2.1 靶點活性口袋及相應(yīng)計算結(jié)果
　　對接過程中靶點活性口袋信息為：半徑14.461 5，坐標-9.204，26.799，36.720，均方根偏差為1.130 9。
　　2.2 已上市藥物與靶點對接
　　統(tǒng)計已上市藥物與靶點相互作用的關(guān)鍵氨基酸，發(fā)現(xiàn)主要非鍵相互作用為氫鍵相互作用和疏水相互作用，具體結(jié)果見表1。
　　活性化合物篩選規(guī)則：化合物的打分值達到閾值（閾值=打分值×80%），且分子對接過程中必須與產(chǎn)生主要非鍵相互作用的3個或3個以上氨基酸發(fā)生相互作用，并選擇性地與產(chǎn)生靜電作用的關(guān)鍵氨基酸作用。
　　2.3 中藥小分子對接結(jié)果分析
　　中藥化合物與靶點對接的結(jié)果見表2。
　　根據(jù)2.2項中的活性化合物篩選規(guī)則，中藥小分子滿足該規(guī)則的化合物有12個，按表2的順序這些化合物分別是棕櫚酸、麥角甾醇、異欖香素型、玉蘭素、去甲氧基姜黃素、正十四碳烷、木犀草素、三十烷醇、常春藤皂苷、羽扇豆醇乙酸酯、氧代千層塔烯二醇、褪黑素。其中棕櫚酸為茯苓和薏苡仁共有的成分，麥角甾醇、異欖香素型化合物為茯苓中所含的成分，玉蘭素、去甲氧基姜黃素、正十四碳烷為薏苡仁中的成分，木犀草素、三十烷醇、常春藤皂苷為桑枝中所含有的成分，羽扇豆醇乙酸酯、氧代千層塔烯二醇為木瓜中的成分，褪黑素是厚樸的成分。
　　現(xiàn)以木犀草素（MOL00745）與雷帕霉素靶蛋白的作用為例分析中藥小分子與靶蛋白之間的相互作用。木犀草素與雷帕霉素靶蛋白發(fā)生相互作用的關(guān)鍵氨基酸是與A：GLU54，A：GLN53，A：TYR82， A：ASP37發(fā)生氫鍵相互作用，與A：HIS87，A：PHE46，A：ILE90，A：VAL55發(fā)生疏水相互作用，與上文分析 　　的已上市藥物及原配體與靶蛋白作用的關(guān)鍵氨基酸相似，由此推測木犀草素與已上市藥物抗衰老的作用機制相似，具有相似的生物活性。然而，化合物棕櫚酸（MOL00069）與靶蛋白作用的關(guān)鍵氨基酸雖有A：TYR82，A：HIS87，A：PHE46發(fā)生氫鍵作用，A：PHE46，A：ILE56，A：ILE90發(fā)生疏水作用，但相關(guān)研究表明棕櫚酸能夠促進人成骨肉瘤細胞MG63細胞的凋亡[27]，且棕櫚酸可以通過多種途徑產(chǎn)生毒性作用[28]，所以推測其為假陽性結(jié)果。
　　利用分子對接技術(shù)對祛濕藥中的抗衰老成分進行篩選發(fā)現(xiàn)，祛濕藥中多種化合物可以作用于雷帕霉素靶蛋白，通過干預(yù)mTOR信號通路起到抗衰老的作用。
　　3 討論
　　近年來，分子對接技術(shù)在先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)[29]、潛在靶標和作用機制的探索[30]以及中藥復(fù)方藥理機制[31]的研究方面均表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢。本研究通過分子對接技術(shù)篩選祛濕藥中具有抗衰老作用的活性成分，其中有部分化合物如去甲氧基姜黃素[32]、木犀草素[33]、褪黑素[34]等已有文獻報道具有抗衰老作用，這些報道與本實驗對接結(jié)果相互佐證，表明本研究方法具有一定的可靠性。對接結(jié)果中也有部分成分至今沒有明確的系統(tǒng)的研究，實驗結(jié)果為抗衰藥物的開發(fā)提供了更多的方向和思路，研究人員可以針對這些成分進行藥理學和毒理學研究。但本研究也有一定的局限，分子對接僅考慮原子間相互作用，以此來推測復(fù)雜的生物體系顯然是不夠的[35]，而且評價方法也具有一定的缺陷，有些得分較高的分子未必就具有較好的生物活性，因此計算結(jié)果并不能代替實驗數(shù)據(jù)，最終還是需要生物學實驗加以驗證。無可厚非，采用分子對接篩選祛濕藥中的抗衰老活性成分的方法是可行的，今后筆者會對評價方法進行優(yōu)化并采取生物學實驗對結(jié)果進行驗證。
　　本文利用分子對接技術(shù)，分析了祛濕藥中具有抗衰老活性的成分，結(jié)果篩選出多種成分均能夠通過作用于雷帕霉素靶蛋白發(fā)揮抗衰老的作用。該結(jié)果初步闡明了祛濕藥能夠產(chǎn)生抗衰老的作用，與中醫(yī)理論中濕邪瘀阻導(dǎo)致衰老的學說相一致。由此，該結(jié)果為從濕論治延緩衰老提供了一個新的方向，為濕邪及衰老引起的疾病的預(yù)防和輔助治療提供了新的思路，也為進一步從中藥中發(fā)現(xiàn)潛在的抗衰老活性成分提供了依據(jù)和指導(dǎo)。
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　　[責任編輯 馬超一]

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