【摘要】：背景:隨著當今社會的發(fā)展,冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CHD)相關的發(fā)生率和致死率較以往明顯升高,其中以急性心肌梗死以及心功能不全為重要的死因。由于心肌細胞為不可再生細胞,心肌梗死后壞死細胞由纖維組織增生和瘢痕修復取代,梗死部位失去正常心肌收縮和傳導能力,導致心臟肌細胞重構和心臟功能不全,鄰近梗死區(qū)的心肌細胞由于缺血缺氧成為冬眠心肌。傳統(tǒng)心肌梗死的治療方案包括藥物治療、介入治療和外科冠脈旁路移植手術,在一定程度上挽救了缺血心肌、改善心�；颊哳A后,但不能使已梗死心肌細胞重生。特別是部分彌漫性血管病變及微小血管病變患者,介入和外科治療效果較差,支架植入后需長期口服抗血小板藥物,外科搭橋后的橋血管也可能再次粥樣硬化甚至閉塞。近年來組織工程和再生醫(yī)學的進展為心肌梗死的治療和康復提供了新的希望,通過細胞移植的方法促進血管新生、挽救缺血心肌、冬眠心肌成為缺血相關心臟疾病新的方向,這種新的治療理念和思路也被稱為“治療性血管生成”。在有關細胞移植及再生治療的臨床和實驗室研究中用到過許多種類細胞,其中包括臍靜脈內(nèi)皮細胞、內(nèi)皮祖細胞、胚胎來源的干細胞、間充質(zhì)多能干細胞等。其中骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone mesenchymal stem cells BMSCs)是一類來源骨髓的,不同于造血干細胞的成體干細胞,具有自我不斷更新的能力和向多方向和譜系分化的潛能,在體外合適的條件誘導后,可向多種細胞類型發(fā)生分化。而且可以自體移植,易于將外源性的基因片段導入,因此成為熱點的種子細胞候選對象。BMSCs在移植后發(fā)揮治療性血管生成作用,主要歸因于其向內(nèi)皮細胞、心肌細胞分化、旁分泌作用促進血管新生,免疫調(diào)節(jié)作用控制梗死后炎癥等。BMSCs向內(nèi)皮樣細胞發(fā)生分化的過程受多種因素調(diào)節(jié),目前其具體機制仍有待深入探尋。Notch信號通道是一種在各物種、各細胞中廣泛存在的高度保守信號途徑,主要通過細胞相互直接接觸的形式傳導,在決定細胞分化方向及命運方面起重要的調(diào)控作用。在心血管系統(tǒng)的正常發(fā)育中Notch信號系統(tǒng)也起重要作用,它的異常激活或缺失都會導致心血管發(fā)育異常甚至是機體死亡。Notch信號通路在內(nèi)皮血管細胞分化及動靜脈選擇、缺血誘導的新生血管形成中也扮演關鍵角色。本課題主要研究了人BMSCs在體外培養(yǎng)中向內(nèi)皮樣細胞誘導分化的可行性及Notch信號在BMSCs向內(nèi)皮樣細胞誘導分化過程中的作用和相關的機制,以便為更好地改進和發(fā)展BMSCs移植治療缺血導致的心血管疾病提供實驗和理論的依據(jù)。第一部分人BMSCs體外培養(yǎng)及誘導其向內(nèi)皮細胞分化目的:體外培養(yǎng)人BMSCs,并用內(nèi)皮細胞誘導劑誘導分化,觀察其細胞形態(tài)、成血管能力、細胞表面標志物改變,明確BMSCs的內(nèi)皮分化潛能。方法:(1)體外貼壁培養(yǎng)人BMSCs原代細胞,增殖傳代至第三代(P3)作為研究對象,采用VEGFA165和b FGF聯(lián)合誘導人BMSCs向內(nèi)皮細胞分化,顯微鏡下觀察誘導前和誘導后細胞間的形態(tài)改變。(2)通過免疫組織細胞化學法,檢測誘導分化過程中各組細胞表面內(nèi)皮細胞相關的標志物Flk-1、v WF的表達情況:實驗中各分組為對照組和誘導組,誘導組經(jīng)過內(nèi)皮誘導液處理10天后取樣做免疫組織化學檢測,將誘導前后細胞接種在基底膜基質(zhì)(matrigel)上觀察其血管形成能力,ac-LDL吞噬實驗觀察細胞吞噬低密度脂蛋白能力。(3)采用蛋白免疫印跡法,觀察誘導前后人BMSCs上Notch配體DLL4表達情況,明確DLL4參與BMSCs向內(nèi)皮分化過程中。結果:(1)人類BMSCs誘導前顯微鏡下形態(tài)為:細長梭狀、紡錘形,經(jīng)VEGFA165和b FGF聯(lián)合誘導后,部分細胞形態(tài)逐漸變?yōu)楸馄健⒍嘟�、短梭狀�?2)人BMSCs在培養(yǎng)基中由VEGFA165和b FGF聯(lián)合處理10d后,免疫組化鑒定表明細胞表達內(nèi)皮細胞相關的標志物Flk-1和v WF。誘導后細胞接種到matrigel后,具備形成毛細血管網(wǎng)樣結構能力,并具有吞噬Ac-LDL能力。(3)人BMSCs在內(nèi)皮細胞誘導液中處理10d后,DLL4的蛋白表達較誘導前明顯升高(P0.01)。結論:1、聯(lián)合VEGF和b FGF誘導人BMSCs第三代細胞向內(nèi)皮樣細胞分化的方案是可行的,誘導的最佳濃度:50ng/ml VEGF+10ngb FGF。分化后細胞從形態(tài)和部分功能上與內(nèi)皮細胞相似。2、誘導人BMSCs向內(nèi)皮細胞分化的過程中,細胞表達的內(nèi)皮相關細胞標志物隨著誘導時間逐漸增加,具備了體外成血管能力和攝取ac-LDL的能力。3、誘導分化處理中,Notch信號的配體DLL4表達上調(diào)。第二部分:DLL4干擾質(zhì)粒和過表達病毒構建及轉(zhuǎn)染h BMSCs目的:采用基因載體技術,將合成的DLL4干擾序列和DLL4 homo序列分別用質(zhì)粒和慢病毒載體攜帶,轉(zhuǎn)染h BMSCs,構建DLL4表達干預模型,為后續(xù)研究Notch信號通路在MSCs內(nèi)皮分化中的作用打下基礎。方法:1通過聚合酶鏈反應(PCR)方法克隆得到目的基因片段,然后與骨架載體質(zhì)粒分別雙酶切,將酶切后的PCR產(chǎn)物與剪切后呈線性化的載體連接,進入感受態(tài)細胞中,經(jīng)過篩選陽性菌落,抽取質(zhì)粒,獲得重組后攜帶目的基因的質(zhì)粒載體。2采用混合寡核苷酸(oligomix)的方法,分別合成DLL4的兩個片段,采用無縫克隆試劑盒連接,在載體LV5中完成重組,感受態(tài)細胞中篩選陽性菌落,抽取質(zhì)粒酶切鑒定,然后進行慢病毒包裝、純化,最后感染h BMSCs。3用蛋白印跡實驗驗證DLL4干擾質(zhì)粒和過表達慢病毒的效果。結果:DLL4干擾質(zhì)粒和過表達慢病毒均可轉(zhuǎn)入h BMSCs,且分別下調(diào)和增高DLL4的表達結論:DLL4干擾和過表達載體構建成功,轉(zhuǎn)染h BMSCs并干預DLL4的表達,可用于后續(xù)實驗。第三部分:Notch信號系統(tǒng)對人骨髓間充質(zhì)干細胞向內(nèi)皮細胞分化的影響目的:通過基因修飾技術,調(diào)高和降低DLL4在人BMSCs中的表達,檢測轉(zhuǎn)染干擾和過表達質(zhì)粒后BMSCs向內(nèi)皮細胞分化能力改變,明確Notch信號通道的相關下游因子在誘導過程中的改變,研究干預Notch信號的表達和激活對誘導之后細胞的內(nèi)皮細胞特征的影響,以便提高誘導后內(nèi)皮細胞增殖能力、遷移能力、促血管生成能力,更好促進BMSCs向內(nèi)皮細胞誘導分化的臨床應用。方法:1、VEGF聯(lián)合b FGF誘導轉(zhuǎn)染了DLL4干擾質(zhì)粒和DLL4過表達慢病毒的人BMSCs向內(nèi)皮細胞分化,免疫組織化學染色檢測誘導細胞Flk-1和v WF表達。2、WB檢測誘導分化過程中Notch信號通路下游分子Notch胞內(nèi)片段(NICD)、Hes1、Hes5及內(nèi)皮標志物Flk-1、v WF的表達,并用Notch1特異性阻斷劑DAPT處理誘導中的人BMSCs,觀察內(nèi)皮細胞標志物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平及細胞成血管能力,吞噬Ac-LDL能力變化。結果:1轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的h BMSC免疫組化染色Flk-1和v WF染色強度為弱陽性,過表達慢病毒轉(zhuǎn)染h BMSC免疫組化Flk-1和v WF中度陽性。2與普通誘導組相比,DLL4過表達h BMSC分化后表達NICD、Hes1、Hes5、Flk-1、v WF增加,DLL4干擾h BMSC分化后表達內(nèi)皮標志物及下游基因表達下降,阻斷Notch信號減少誘導處理后細胞表面內(nèi)皮細胞標志物及Notch下游基因表達。3與普通誘導組相比,DLL4過表達h BMSC誘導分化后體外成血管能力增強,DLL4干擾h BMSC誘導后體外成血管能力和吞噬ac-LDL能力減弱,誘導晚期加入DAPT促進誘導細胞在膠體基質(zhì)上形成血管網(wǎng)樣結構的能力。結論:DLL4-Notch信號通路激活在VEGF+b FGF誘導h BMSC內(nèi)皮方向分化過程中起促進作用,在誘導晚期阻斷Notch受體后,分化后細胞在體外血管形成實驗中生成更多血管網(wǎng)狀結構。第四部分:卡諾醇對抗氧化應激促進大鼠骨髓多能成體祖細胞向內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化目的:了解抗氧化劑卡諾醇保護間充質(zhì)干細胞對抗氧化壓力并促進內(nèi)皮樣分化的作用和機制,為抗氧化劑和Noch信號通路聯(lián)合誘導間充質(zhì)干細胞分化打下基礎。方法:(1)大鼠MAPCs的培養(yǎng)及H_2O_2和卡諾醇對細胞增殖和活力的影響,MTT法檢測細胞活性;(2)VEGF誘導大鼠MAPCs向內(nèi)皮細胞分化,分別在卡諾醇預處理和未處理組里加入H_2O_2,檢測活性氧簇水平ROS生成和細胞凋亡酶3活性;(3)蛋白印跡法檢測誘導10d后的細胞內(nèi)皮標志物及Nrf-2表達。結果:(1)H_2O_2對大鼠MAPCs的細胞增殖能力和活性產(chǎn)生抑制,MTT分析細胞呈濃度依賴性死亡,在27 um/L濃度達到50%死亡,卡諾醇預處理能呈劑量依賴提高細胞存活,濃度在0.2um/L時保護最強;(2)在MAPCs向內(nèi)皮誘導分化過程中,H_2O_2明顯增加了細胞的ROS水平、細胞凋亡酶3活性以及細胞凋亡率,而卡諾醇預處理可對抗這些作用;(3)檢測誘導分化10天后的細胞內(nèi)皮標志物發(fā)現(xiàn)H_2O_2處理組與對照組相比,OCT-4,Flk-1,CD 31表達明顯下調(diào)。但是卡諾醇預處理后的H_2O_2處理組細胞內(nèi)皮標志物上調(diào),H_2O_2處理組與對照組相比Nrf-2表達減低,而卡諾醇預處理組與H_2O_2處理組相比明顯增加了Nrf-2表達。結論:大鼠MAPCs向內(nèi)皮分化過程中,H_2O_2增加細胞活性氧蔟水平和細胞凋亡,下調(diào)內(nèi)皮細胞標志物表達,抗氧化劑卡諾醇預處理可促進內(nèi)皮標志物表達和Nrf-2表達。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R54

【參考文獻】

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本文編號：2487697