【摘要】：背景:隨著當今社會的發(fā)展,冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CHD)相關(guān)的發(fā)生率和致死率較以往明顯升高,其中以急性心肌梗死以及心功能不全為重要的死因。由于心肌細胞為不可再生細胞,心肌梗死后壞死細胞由纖維組織增生和瘢痕修復(fù)取代,梗死部位失去正常心肌收縮和傳導(dǎo)能力,導(dǎo)致心臟肌細胞重構(gòu)和心臟功能不全,鄰近梗死區(qū)的心肌細胞由于缺血缺氧成為冬眠心肌。傳統(tǒng)心肌梗死的治療方案包括藥物治療、介入治療和外科冠脈旁路移植手術(shù),在一定程度上挽救了缺血心肌、改善心�；颊哳A(yù)后,但不能使已梗死心肌細胞重生。特別是部分彌漫性血管病變及微小血管病變患者,介入和外科治療效果較差,支架植入后需長期口服抗血小板藥物,外科搭橋后的橋血管也可能再次粥樣硬化甚至閉塞。近年來組織工程和再生醫(yī)學(xué)的進展為心肌梗死的治療和康復(fù)提供了新的希望,通過細胞移植的方法促進血管新生、挽救缺血心肌、冬眠心肌成為缺血相關(guān)心臟疾病新的方向,這種新的治療理念和思路也被稱為“治療性血管生成”。在有關(guān)細胞移植及再生治療的臨床和實驗室研究中用到過許多種類細胞,其中包括臍靜脈內(nèi)皮細胞、內(nèi)皮祖細胞、胚胎來源的干細胞、間充質(zhì)多能干細胞等。其中骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone mesenchymal stem cells BMSCs)是一類來源骨髓的,不同于造血干細胞的成體干細胞,具有自我不斷更新的能力和向多方向和譜系分化的潛能,在體外合適的條件誘導(dǎo)后,可向多種細胞類型發(fā)生分化。而且可以自體移植,易于將外源性的基因片段導(dǎo)入,因此成為熱點的種子細胞候選對象。BMSCs在移植后發(fā)揮治療性血管生成作用,主要歸因于其向內(nèi)皮細胞、心肌細胞分化、旁分泌作用促進血管新生,免疫調(diào)節(jié)作用控制梗死后炎癥等。BMSCs向內(nèi)皮樣細胞發(fā)生分化的過程受多種因素調(diào)節(jié),目前其具體機制仍有待深入探尋。Notch信號通道是一種在各物種、各細胞中廣泛存在的高度保守信號途徑,主要通過細胞相互直接接觸的形式傳導(dǎo),在決定細胞分化方向及命運方面起重要的調(diào)控作用。在心血管系統(tǒng)的正常發(fā)育中Notch信號系統(tǒng)也起重要作用,它的異常激活或缺失都會導(dǎo)致心血管發(fā)育異常甚至是機體死亡。Notch信號通路在內(nèi)皮血管細胞分化及動靜脈選擇、缺血誘導(dǎo)的新生血管形成中也扮演關(guān)鍵角色。本課題主要研究了人BMSCs在體外培養(yǎng)中向內(nèi)皮樣細胞誘導(dǎo)分化的可行性及Notch信號在BMSCs向內(nèi)皮樣細胞誘導(dǎo)分化過程中的作用和相關(guān)的機制,以便為更好地改進和發(fā)展BMSCs移植治療缺血導(dǎo)致的心血管疾病提供實驗和理論的依據(jù)。第一部分人BMSCs體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)其向內(nèi)皮細胞分化目的:體外培養(yǎng)人BMSCs,并用內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)分化,觀察其細胞形態(tài)、成血管能力、細胞表面標志物改變,明確BMSCs的內(nèi)皮分化潛能。方法:(1)體外貼壁培養(yǎng)人BMSCs原代細胞,增殖傳代至第三代(P3)作為研究對象,采用VEGFA165和b FGF聯(lián)合誘導(dǎo)人BMSCs向內(nèi)皮細胞分化,顯微鏡下觀察誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后細胞間的形態(tài)改變。(2)通過免疫組織細胞化學(xué)法,檢測誘導(dǎo)分化過程中各組細胞表面內(nèi)皮細胞相關(guān)的標志物Flk-1、v WF的表達情況:實驗中各分組為對照組和誘導(dǎo)組,誘導(dǎo)組經(jīng)過內(nèi)皮誘導(dǎo)液處理10天后取樣做免疫組織化學(xué)檢測,將誘導(dǎo)前后細胞接種在基底膜基質(zhì)(matrigel)上觀察其血管形成能力,ac-LDL吞噬實驗觀察細胞吞噬低密度脂蛋白能力。(3)采用蛋白免疫印跡法,觀察誘導(dǎo)前后人BMSCs上Notch配體DLL4表達情況,明確DLL4參與BMSCs向內(nèi)皮分化過程中。結(jié)果:(1)人類BMSCs誘導(dǎo)前顯微鏡下形態(tài)為:細長梭狀、紡錘形,經(jīng)VEGFA165和b FGF聯(lián)合誘導(dǎo)后,部分細胞形態(tài)逐漸變?yōu)楸馄�、多角、短梭狀�?2)人BMSCs在培養(yǎng)基中由VEGFA165和b FGF聯(lián)合處理10d后,免疫組化鑒定表明細胞表達內(nèi)皮細胞相關(guān)的標志物Flk-1和v WF。誘導(dǎo)后細胞接種到matrigel后,具備形成毛細血管網(wǎng)樣結(jié)構(gòu)能力,并具有吞噬Ac-LDL能力。(3)人BMSCs在內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)液中處理10d后,DLL4的蛋白表達較誘導(dǎo)前明顯升高(P0.01)。結(jié)論:1、聯(lián)合VEGF和b FGF誘導(dǎo)人BMSCs第三代細胞向內(nèi)皮樣細胞分化的方案是可行的,誘導(dǎo)的最佳濃度:50ng/ml VEGF+10ngb FGF。分化后細胞從形態(tài)和部分功能上與內(nèi)皮細胞相似。2、誘導(dǎo)人BMSCs向內(nèi)皮細胞分化的過程中,細胞表達的內(nèi)皮相關(guān)細胞標志物隨著誘導(dǎo)時間逐漸增加,具備了體外成血管能力和攝取ac-LDL的能力。3、誘導(dǎo)分化處理中,Notch信號的配體DLL4表達上調(diào)。第二部分:DLL4干擾質(zhì)粒和過表達病毒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染h BMSCs目的:采用基因載體技術(shù),將合成的DLL4干擾序列和DLL4 homo序列分別用質(zhì)粒和慢病毒載體攜帶,轉(zhuǎn)染h BMSCs,構(gòu)建DLL4表達干預(yù)模型,為后續(xù)研究Notch信號通路在MSCs內(nèi)皮分化中的作用打下基礎(chǔ)。方法:1通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法克隆得到目的基因片段,然后與骨架載體質(zhì)粒分別雙酶切,將酶切后的PCR產(chǎn)物與剪切后呈線性化的載體連接,進入感受態(tài)細胞中,經(jīng)過篩選陽性菌落,抽取質(zhì)粒,獲得重組后攜帶目的基因的質(zhì)粒載體。2采用混合寡核苷酸(oligomix)的方法,分別合成DLL4的兩個片段,采用無縫克隆試劑盒連接,在載體LV5中完成重組,感受態(tài)細胞中篩選陽性菌落,抽取質(zhì)粒酶切鑒定,然后進行慢病毒包裝、純化,最后感染h BMSCs。3用蛋白印跡實驗驗證DLL4干擾質(zhì)粒和過表達慢病毒的效果。結(jié)果:DLL4干擾質(zhì)粒和過表達慢病毒均可轉(zhuǎn)入h BMSCs,且分別下調(diào)和增高DLL4的表達結(jié)論:DLL4干擾和過表達載體構(gòu)建成功,轉(zhuǎn)染h BMSCs并干預(yù)DLL4的表達,可用于后續(xù)實驗。第三部分:Notch信號系統(tǒng)對人骨髓間充質(zhì)干細胞向內(nèi)皮細胞分化的影響目的:通過基因修飾技術(shù),調(diào)高和降低DLL4在人BMSCs中的表達,檢測轉(zhuǎn)染干擾和過表達質(zhì)粒后BMSCs向內(nèi)皮細胞分化能力改變,明確Notch信號通道的相關(guān)下游因子在誘導(dǎo)過程中的改變,研究干預(yù)Notch信號的表達和激活對誘導(dǎo)之后細胞的內(nèi)皮細胞特征的影響,以便提高誘導(dǎo)后內(nèi)皮細胞增殖能力、遷移能力、促血管生成能力,更好促進BMSCs向內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)分化的臨床應(yīng)用。方法:1、VEGF聯(lián)合b FGF誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染了DLL4干擾質(zhì)粒和DLL4過表達慢病毒的人BMSCs向內(nèi)皮細胞分化,免疫組織化學(xué)染色檢測誘導(dǎo)細胞Flk-1和v WF表達。2、WB檢測誘導(dǎo)分化過程中Notch信號通路下游分子Notch胞內(nèi)片段(NICD)、Hes1、Hes5及內(nèi)皮標志物Flk-1、v WF的表達,并用Notch1特異性阻斷劑DAPT處理誘導(dǎo)中的人BMSCs,觀察內(nèi)皮細胞標志物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平及細胞成血管能力,吞噬Ac-LDL能力變化。結(jié)果:1轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的h BMSC免疫組化染色Flk-1和v WF染色強度為弱陽性,過表達慢病毒轉(zhuǎn)染h BMSC免疫組化Flk-1和v WF中度陽性。2與普通誘導(dǎo)組相比,DLL4過表達h BMSC分化后表達NICD、Hes1、Hes5、Flk-1、v WF增加,DLL4干擾h BMSC分化后表達內(nèi)皮標志物及下游基因表達下降,阻斷Notch信號減少誘導(dǎo)處理后細胞表面內(nèi)皮細胞標志物及Notch下游基因表達。3與普通誘導(dǎo)組相比,DLL4過表達h BMSC誘導(dǎo)分化后體外成血管能力增強,DLL4干擾h BMSC誘導(dǎo)后體外成血管能力和吞噬ac-LDL能力減弱,誘導(dǎo)晚期加入DAPT促進誘導(dǎo)細胞在膠體基質(zhì)上形成血管網(wǎng)樣結(jié)構(gòu)的能力。結(jié)論:DLL4-Notch信號通路激活在VEGF+b FGF誘導(dǎo)h BMSC內(nèi)皮方向分化過程中起促進作用,在誘導(dǎo)晚期阻斷Notch受體后,分化后細胞在體外血管形成實驗中生成更多血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。第四部分:卡諾醇對抗氧化應(yīng)激促進大鼠骨髓多能成體祖細胞向內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化目的:了解抗氧化劑卡諾醇保護間充質(zhì)干細胞對抗氧化壓力并促進內(nèi)皮樣分化的作用和機制,為抗氧化劑和Noch信號通路聯(lián)合誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化打下基礎(chǔ)。方法:(1)大鼠MAPCs的培養(yǎng)及H_2O_2和卡諾醇對細胞增殖和活力的影響,MTT法檢測細胞活性;(2)VEGF誘導(dǎo)大鼠MAPCs向內(nèi)皮細胞分化,分別在卡諾醇預(yù)處理和未處理組里加入H_2O_2,檢測活性氧簇水平ROS生成和細胞凋亡酶3活性;(3)蛋白印跡法檢測誘導(dǎo)10d后的細胞內(nèi)皮標志物及Nrf-2表達。結(jié)果:(1)H_2O_2對大鼠MAPCs的細胞增殖能力和活性產(chǎn)生抑制,MTT分析細胞呈濃度依賴性死亡,在27 um/L濃度達到50%死亡,卡諾醇預(yù)處理能呈劑量依賴提高細胞存活,濃度在0.2um/L時保護最強;(2)在MAPCs向內(nèi)皮誘導(dǎo)分化過程中,H_2O_2明顯增加了細胞的ROS水平、細胞凋亡酶3活性以及細胞凋亡率,而卡諾醇預(yù)處理可對抗這些作用;(3)檢測誘導(dǎo)分化10天后的細胞內(nèi)皮標志物發(fā)現(xiàn)H_2O_2處理組與對照組相比,OCT-4,Flk-1,CD 31表達明顯下調(diào)。但是卡諾醇預(yù)處理后的H_2O_2處理組細胞內(nèi)皮標志物上調(diào),H_2O_2處理組與對照組相比Nrf-2表達減低,而卡諾醇預(yù)處理組與H_2O_2處理組相比明顯增加了Nrf-2表達。結(jié)論:大鼠MAPCs向內(nèi)皮分化過程中,H_2O_2增加細胞活性氧蔟水平和細胞凋亡,下調(diào)內(nèi)皮細胞標志物表達,抗氧化劑卡諾醇預(yù)處理可促進內(nèi)皮標志物表達和Nrf-2表達。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R54

【參考文獻】

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本文編號：2487697