【摘要】：研究背景:地塞米松(Dexamethasone,Dex)是一種典型的人工合成糖皮質(zhì)激素,通過與糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid Receptors,GR)結(jié)合發(fā)揮作用,作為臨床上常用的處方藥物之一,被廣泛應(yīng)用于白血病/淋巴瘤的治療,但其作用機(jī)制至今尚未完全明了。DOT1L(disruptor of telomere silencing 1 like)是至今為止唯一可催化組蛋白H3第79位賴氨酸(H3K79)發(fā)生甲基化的一類特殊的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶。除參與染色質(zhì)沉默、基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞衰老和DNA損傷修復(fù)等生物學(xué)過程外,近年來也被陸續(xù)證實(shí)參與了多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展,如肺癌,乳腺癌,卵巢癌,腎透明細(xì)胞癌,神經(jīng)母細(xì)胞瘤等,其中尤其是與MLL基因重排型白血病(MLL-rearranged leukemias)的關(guān)系受到國內(nèi)外許多學(xué)者的持續(xù)追蹤研究。DOT1L通過與MLL融合蛋白相互作用,異常修飾H3K79高甲基化,致促白血病發(fā)生發(fā)展的基因(MEIS1、Hoxa9等)持續(xù)活化,從而促進(jìn)MLL重排型白血病的發(fā)生發(fā)展。因此DOT1L被認(rèn)為是該型白血病新的治療靶點(diǎn),其特異性小分子抑制劑也正處于臨床Ⅰ期試驗(yàn)階段。然而DOT1L是否參與促進(jìn)B淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展以及DOT1L能否受Dex調(diào)控,至今仍未報(bào)道。研究目的:研究Dex對DOT1L的表達(dá)調(diào)控及其分子機(jī)制在其抑制B淋巴瘤和MLL基因重排型白血病細(xì)胞增殖中的作用。研究方法:(1)分別提取B淋巴瘤細(xì)胞(Raji、Namalwa、Daudi、Jeko-1)、人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞THP-1和MLL重排型白血病細(xì)胞MV4-11的組蛋白,通過Western blot檢測DOT1L/H3K79的基礎(chǔ)蛋白水平;用TCGA數(shù)據(jù)庫分析DOT1L在血液系統(tǒng)腫瘤與正常組織中的差異表達(dá)情況。(2)用GR激動劑Dex分別處理B淋巴瘤細(xì)胞Raji、人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞THP-1和MLL基因重排型白血病細(xì)胞MV4-11,首先提取m RNA、逆轉(zhuǎn)錄為c DNA、通過Real-time PCR從轉(zhuǎn)錄水平檢測DOT1L及其靶基因MEIS1的表達(dá)情況;然后提取細(xì)胞組蛋白,通過Western blot從翻譯水平檢測DOT1L效應(yīng)蛋白H3K79甲基化水平;CCK-8法檢測增殖情況。(3)以GR拮抗劑RU486米非司酮(Mifepristone,Mfp)預(yù)處理上述細(xì)胞,再與Dex共孵育,通過Real-time PCR、Western blot分別從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平檢測DOT1L、MEIS1表達(dá)情況;CCK-8法檢測增殖情況。(4)合成特異性針對DOT1L的siRNA,轉(zhuǎn)染入Raji細(xì)胞,CCK-8法檢測Raji增殖情況。(5)在核受體網(wǎng)站上預(yù)測DOT1L的啟動子區(qū)含有GR的結(jié)合位點(diǎn),構(gòu)建含GR結(jié)合位點(diǎn)的DOT1L上游啟動子區(qū)(-1800~+200bp)重組質(zhì)粒,用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測GR激動劑Dex及GR拮抗劑RU486對該區(qū)段DOT1L啟動子活性的影響。(6)用放線菌素Act D(Actinomycin D)預(yù)處理,再與Dex共孵育,通過Real-time PCR從轉(zhuǎn)錄后水平檢測DOT1L表達(dá)情況。研究結(jié)果:(1)DOT1L在血液系統(tǒng)腫瘤組織中表達(dá)水平明顯高于正常組織;細(xì)胞水平上,相比于高表達(dá)DOT1L的MV4-11細(xì)胞,DOT1L在各B淋巴瘤細(xì)胞系中表達(dá)水平相對較高,而DOT1L在人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞THP-1中表達(dá)水平較低。(2)Dex抑制Raji細(xì)胞和MV4-11細(xì)胞增殖;并能下調(diào)Raji細(xì)胞中DOT1L及其靶基因MEIS1的m RNA水平和DOT1L效應(yīng)蛋白H3K79甲基化水平;對于MV4-11細(xì)胞,Dex僅能下調(diào)DOT1L效應(yīng)蛋白H3K79甲基化水平,其mRNA水平不受影響。其中,THP-1細(xì)胞的增殖水平以及DOT1L表達(dá)水平不受Dex影響,是本實(shí)驗(yàn)體系中的陰性對照。(3)上述實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象均能被米非司酮RU486所阻斷,說明Dex對DOT1L的下調(diào)作用是通過活化GR來完成。(4)干擾DOT1L能明顯抑制B淋巴瘤細(xì)胞Raji的增殖。(5)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明Dex不是通過影響-1800bp~+200bp區(qū)段DOT1L啟動子活性來下調(diào)其表達(dá),說明存在其他調(diào)節(jié)機(jī)制。(6)Dex通過在轉(zhuǎn)錄后水平抑制DOT1L mRNA穩(wěn)定性來下調(diào)B淋巴瘤細(xì)胞Raji中DOT1L表達(dá)。研究結(jié)論:(1)DOT1L在B淋巴瘤細(xì)胞系中表達(dá)水平相對較高。(2)研究首次發(fā)現(xiàn)Dex通過活化GR下調(diào)DOT1L基因的表達(dá)至少是其殺傷B淋巴瘤細(xì)胞和MLL基因重排型白血病細(xì)胞的部分機(jī)制。(3)在B淋巴瘤細(xì)胞Raji中,Dex通過抑制DOT1L穩(wěn)定性來下調(diào)DOT1L表達(dá),而非影響其啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性。(4)研究首次發(fā)現(xiàn)DOT1L具有促進(jìn)B淋巴瘤細(xì)胞增殖的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R733

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本文編號：2458445