【摘要】：目的本研究主要探討缺氧對大鼠心肌細胞造成的損傷及引起損傷的機制,為心力衰竭等疾病的臨床治療積累理論資料。方法(1)實驗設計及分組:以大鼠心肌細胞株(H9C2)為材料,設計實驗組與對照組,實驗組條件為1%O2+5%CO2+94%N2、37℃條件下三氣培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng);對照組條件為95%Air、5%CO2、37℃CO2培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)。分別設3h、6h、12h、24h、48h時段取材,觀察細胞的各項指標。(2)細胞的生長及活力的觀察:分段取材使用臺盼藍對其染色,使用全自動細胞計數(shù)儀進行細胞計數(shù)并繪制細胞生長曲線;利用ELISA法和CCK-8試劑盒檢測各時間點的OD值來判斷細胞活力;使用細胞實時觀測儀(Cellasic)在不同時間點內(nèi)連續(xù)觀測細胞生長變化情況以及缺氧對細胞造成的損傷狀態(tài)。(3)線粒體功能檢測:對培養(yǎng)24h時兩組細胞取材并固定切片,利用透射電鏡觀察不同缺氧時間下改變;使用活性氧檢測試劑盒通過流式細胞術檢測各時間點下細胞內(nèi)活性氧含量的變化;以線粒體呼吸鏈中核心蛋白線粒體色素C為靶蛋白,通過Western blot法檢測各時間段的表達水平,以此判斷對線粒體的損傷程度。(4)細胞凋亡的觀察:利用ELISA法檢測細胞各時期的吸光度來驗證凋亡因子caspase 3的活性程度;使用熒光染料Hoest 33342對0h、24h、48h的兩組細胞進行染色,借助熒光顯微鏡直觀判斷細胞的凋亡情況;使用7-AAD及Annexin V-APC對細胞進行標記再利用流式細胞術檢測各時間段兩組細胞的早期凋亡率。(5)細胞壞死的觀察:使用ELISA法檢測乳酸脫氫酶(LDH)在各時間段的表達程度,以此為指標判斷細胞壞死程度。結果(1)細胞的生長及活力的觀察:通過細胞計數(shù)儀觀察隨著缺氧時間的增加,心肌細胞生長速率不斷減慢。與對照組相比,24h時兩組細胞生長差異最大,缺氧24h組比對照組細胞生長率下降了1.53倍(P0.01)。使用CCK-8試劑盒檢測出隨著缺氧時間的增加,心肌細胞存活率均明顯降低。6h時兩組細胞生長差異最大,缺氧6h組比對照組細胞生長率下降了1.53倍(P0.01)。通過細胞生長的實時動態(tài)觀測發(fā)現(xiàn)缺氧6小時后心肌細胞形態(tài)開始發(fā)生改變,缺氧12小時后心肌細胞的胞質(zhì)出現(xiàn)空泡和細胞皺縮,缺氧48小時細胞基本全部死亡。(2)線粒體功能檢測:透射電鏡下缺氧24小時可見心肌細胞線粒體結構明顯損傷。缺氧6小時開始,ROS釋放水平開始升高,24h兩組細胞內(nèi)ROS水平差異最大,缺氧24h組細胞內(nèi)ROS的表達水平升高了7.59倍(P0.01)。細胞內(nèi)細胞色素C含量在缺氧3小時處開始出現(xiàn)差異,與正常組比較,缺氧3h組細胞色素C蛋白的表達水平升高了0.79倍(P0.01)。與缺氧12h組比較,缺氧24h組細胞色素C蛋白的表達水平升高了0.41倍(P0.01)。(3)細胞凋亡的觀察:隨著缺氧時間的增加,caspase-3活性水平也不斷增加,缺氧3小時處開始出現(xiàn)差異,與正常組比較,缺氧3h組caspase-3活性水平升高了0.67倍(P0.01)。缺氧48小時活性最高,與缺氧24h組比較,缺氧48h組caspase-3活性水平升高了0.27倍(P0.01)。通過熒光顯微鏡觀察到,缺氧培養(yǎng)的大鼠心肌細胞缺氧處理24h、48h后,細胞呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學變化。通過流式細胞術反映出隨著缺氧時間的不斷增加心肌細胞的早期凋亡率明顯增加。缺氧24h細胞凋亡率最高,與正常組比較,缺氧24h組細胞凋亡水平升高了14.14倍(P0.01)。(4)細胞壞死的觀察:利用ELISA法檢測出隨著缺氧時間的增加心肌細胞乳酸脫氫酶(LDH)的釋放率明顯增高,缺氧48小時釋放率最高,與正常組相比,缺氧組的乳酸脫氫酶LDH水平升高了3.1倍(P0.01)。結論缺氧能夠造成大鼠心肌細胞株(H9C2)的細胞生長、存活率均明顯降低、細胞形態(tài)明顯改變以及線粒體損傷,線粒體損傷會導致細胞凋亡,缺氧時間的增加會造成細胞壞死。
[Abstract]:Objective To study the mechanism of hypoxia on the myocardial cells of rats and the mechanism of injury, and to accumulate the theoretical data for the clinical treatment of heart failure and other diseases. Method (1) Experimental design and grouping: The experimental group and the control group were designed with the rat myocardial cell line (H9C2) as the material. The condition of the experimental group was 1% O2 + 5% CO2 + 94% N2, and the condition of the control group was 95% Air,5% CO2, and the CO2 incubator at 37 鈩，

本文編號：2446705