發(fā)布時(shí)間：2019-03-05 20:51

【摘要】：研究目的：血栓性疾病是臨床常見病,嚴(yán)重危害著人類的健康及生命。血管一旦形成血栓,便可使累及的血管狹窄甚至閉塞,造成相應(yīng)的器官或者組織缺血而致功能障礙、器官或者組織壞死,往往造成不可逆轉(zhuǎn)的嚴(yán)重后果,甚至是死亡。血栓形成是中國前三位的致死性心血管病——心臟病、腦卒中和靜脈血栓栓塞癥(VTE)的共同發(fā)病機(jī)制。尤其是肺血栓栓塞癥致死率高,臨床癥狀多樣,缺乏特異性,臨床上漏診與誤診情況嚴(yán)重,及時(shí)、準(zhǔn)確進(jìn)行診斷至關(guān)重要。目前用于診斷血栓的檢測(cè)方法非常多,但是超聲、CT、MRI、DSA、SPECT等檢測(cè)方法都有各自的缺陷。因此尋找一種經(jīng)濟(jì)的、敏感的手段變得十分迫切。前期研究表明,P1Cm(專利號(hào)ZL 201110341296.X,結(jié)締組織生長因子小肽)能夠靶向結(jié)合血小板表面高表達(dá)蛋白αIIbp3,我們?cè)噲D用噬菌體展示技術(shù)將P1Cm肽展示在噬菌體表面,以噬菌體作為納米載體制備近紅外探針用于血栓的靶向成像研究。第一部分噬菌體展示載體的構(gòu)建及重組噬菌體的制備方法：利用噬菌體展示技術(shù),通過基因工程方法對(duì)野生噬菌體M13進(jìn)行突變,將目的肽片段插入其中構(gòu)建出重組噬菌體,獲得重組噬菌體；通過ELISA、PCR,及基因測(cè)序等方法驗(yàn)證構(gòu)建是否成功；同時(shí),用CCK8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)考察重組噬菌體的細(xì)胞毒性。結(jié)果：通過ELISA、Q-PCR,酶切鑒定、基因測(cè)序等方法驗(yàn)證我們成功構(gòu)建了重組噬菌體載體,并引入Kpn Ⅰ和Eag Ⅰ酶切位點(diǎn)；通過PEG8000/NaCl沉淀法獲得了高純度重組噬菌體；細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明,重組噬菌體對(duì)細(xì)胞存活率幾乎沒有影響。結(jié)論：通過噬菌體展示技術(shù)成功構(gòu)建了能展示任意已知肽的噬菌體載體,并通過轉(zhuǎn)化及感染獲得目的重組噬菌體,該噬菌體無明顯細(xì)胞毒作用。第二部分重組噬菌體與血小板體外結(jié)合研究方法：用FITC及CY5.5標(biāo)記重組噬菌體,純化后得到熒光探針,評(píng)估其穩(wěn)定性；用CCK8實(shí)驗(yàn)考察熒光探針的細(xì)胞毒性；將熒光探針分別與血小板共孵育,用流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡考察熒光探針與血小板的結(jié)合。結(jié)果：標(biāo)記后的重組噬菌體在4周時(shí)間里穩(wěn)定性較好；噬菌體熒光探針對(duì)細(xì)胞存活率沒有明顯影響；流式細(xì)胞術(shù)及激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示,重組噬菌體熒光探針能夠通過膜表面糖蛋白αⅡbβ3中的β3亞基與血小板特異性結(jié)合,且熒光強(qiáng)度大于熒光素標(biāo)記的P1Cm肽。結(jié)論：成功制備了基于重組噬菌體的靶向納米探針,該探針能與血小板表面的β3亞基特異性結(jié)合。第三部分重組噬菌體納米探針用于動(dòng)物動(dòng)脈血栓靶向成像的研究方法：利用三氯化鐵誘導(dǎo)建立裸鼠頸動(dòng)脈血栓模型,并將熒光探針經(jīng)尾靜脈注射入動(dòng)物體內(nèi),利用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)對(duì)血栓部位進(jìn)行近紅外成像；成像結(jié)束離體重要臟器進(jìn)行近紅外成像。將離體的頸動(dòng)脈進(jìn)行HE染色進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè),并制作頸動(dòng)脈、心臟、肝臟、腎臟切片與探針雜交,在激光共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果：用三氯化鐵可以成功誘導(dǎo)裸鼠頸動(dòng)脈血栓模型；將CY5.5-M13-P1Cm與CY5.5-P1Cm熒光探針經(jīng)尾靜脈注射入小動(dòng)物體內(nèi)后,發(fā)現(xiàn)兩者均能夠?qū)ρú课贿M(jìn)行成像,并且CY5.5-M13-P1Cm探針成像效果優(yōu)于CY5.5-P1Cm;同時(shí),CY5.5-M13-P1Cm探針成像時(shí)間更久、更穩(wěn)定。熒光雜交試驗(yàn)結(jié)果顯示,CY5.5-M13-P1Cm及CY5.5-P1Cm探針均可與血栓特異性結(jié)合,但CY5.5-M13-P1Cm探針的熒光信號(hào)強(qiáng)度及分布大于CY5.5-P1Cm探針,與在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。結(jié)論：重組噬菌體CY5.5-M13-P1Cm近紅外熒光探針能夠靶向血栓成像,持續(xù)時(shí)間及熒光強(qiáng)度大于單分子標(biāo)記的CY5.5-P1Cm探針,為重組噬菌體作為納米靶向載體的深入研究打下理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R54

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本文編號(hào)：2435274