【摘要】：背景和目的再生障礙性貧血(aplastic anemia,AA)是一種常見的骨髓衰竭癥,其病因多樣、發(fā)病機理復雜。造血微環(huán)境缺陷是導致再生障礙性貧血發(fā)病的機制之一。尤其是骨髓基質細胞之一的間充質干細胞的缺陷很可能是導致再生障礙性貧血發(fā)生的重要環(huán)節(jié)之一;再生障礙性貧血的治療除雄激素、免疫抑制劑以外,造血干細胞移植是非常重要的手段,但供體細胞來源的不足和嚴重的移植物抗宿主病(GVHD)是阻礙這種技術開展的重要障礙。間充質干細胞(Mesenchymal stem cell,MSC)的特點為該類細胞共有的自我更新、復制能力以及多向分化潛能,可進一步分化為造血細胞,并且可以支持造血、調節(jié)免疫功能,是骨髓造血微環(huán)境的重要組成成分。間充質干細胞具有低的免疫原性和可移植性,正在逐步成為細胞治療的重要種子細胞。間充質干細胞和造血干細胞共移植可以促進造血干細胞植入、減少GVHD的發(fā)生。肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)作為一種細胞因子具有促進細胞生長作用,同時對血管生成、細胞分裂等均有影響,還可以對造血干、祖細胞向造血部位(骨髓)遷移起著促進和誘導的作用。表達HGF的相關基因可以通過腺病毒等載體轉染入間充質干細胞內,使間充質干細胞表達HGF增多,多數(shù)的研究表明HGF基因的修飾對間充質干細胞促進細胞修復、調節(jié)免疫等方面功能有增強的作用。但HGF基因修飾的間充質干細胞對造血功能的影響方面的研究卻比較少。本研究的目的是在我院前期臨床經驗的基礎上,通過動物實驗探討人臍帶來源間充質干細胞(Human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,h UMSC)對再障模型小鼠造血功能的影響、HGF和間充質干細胞在對再障模型小鼠造血功能的影響上是否有協(xié)同作用,HGF基因修飾的間充質干細胞系的構建和其在再生障礙性貧血臨床治療中的潛在的價值。材料與方法第一部分:回顧性分析新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院血液科2009年1月至2014年12月重型再生障礙性貧血(SAA)接受人臍帶來源間充質干細胞聯(lián)合外周血干細胞共移植病例6例,其中SAAⅠ型2例,SAAⅡ型4例,移植前均接受環(huán)孢菌素(CSA)及雄性激素治療并不同數(shù)量輸血,供者均為HLA配型6/6全相合同胞,其中男性供者4例,女性供者2例,血型不合1例。預處理方案為經典“環(huán)磷酰胺+ATG”的基礎上加氟達拉濱;短療程氨甲蝶呤(MTX)加環(huán)孢菌素預防GVHD;患者住無菌的移植病房;注意加強支持治療。0天輸注外周血干細胞CD34+細胞4.18(2.75-6.46)×106/kg(患者)輸注造血干細胞前4小時輸注人臍帶來源的間充質干細胞2.71(2.4-3.0)×1010個。觀察預處理方案不良反應,輸注造血干細胞過及間充質干細胞過程是否是順利;造血功能恢復時間的觀察;GVHD及其他并發(fā)癥發(fā)生的情況以及供者干細胞植入情況。第二部分:我們通過貼壁培養(yǎng)法,獲得人臍帶來源的間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells、h UMSC),通過流式細胞儀檢測間充質干細胞的表面抗原標志、通過誘導成神經細胞分化和成脂肪分化來鑒定間充質干細胞的特性。應用攜帶HGF基因的腺病毒載體(Ad-HGF)轉染間充質干細胞,MOI為150 pfu/細胞,轉染時間48小時。應用免疫標記法(Western blot)及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測轉染后人臍帶來源間充質干細胞HGF的表達。同時通過流式細胞儀對表面標志進行相應的檢測,應用成神經細胞和成脂肪分化過程來檢測Ad-HGF轉染對人臍帶來源間充質干細胞的影響。第三部分:我們將24只BABL/C小鼠分為實驗對照組、h UMSC組、Ad-HGF修飾MSC組,應用6MV的X線均勻照射各組小鼠,照射后第2、4、6天,給每只小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg/kg、氯霉素62.5mg/kg。造模后第8天MSC組經小鼠尾靜脈給h UMSC懸液注射含細胞數(shù)5×107個、Ad-HGF修飾MSC組經小鼠尾靜脈注射Ad-HGF修飾的MSC懸液0.2ml含細胞數(shù)5×107個,并于注射后第2天應用ELISA法檢測模型小鼠外周血中HGF的含量。實驗對照組等量注射生理鹽水。造模后每天觀察小鼠一般情況同時測量體重等指標。造模后第8天取血觀察三組血常規(guī)變化、同時取骨髓行骨髓涂片、骨髓活檢的檢查;瀕死小鼠及死亡小鼠解剖觀察;觀察造模后第21天血常規(guī),評價小鼠再障模型的穩(wěn)定性及3組小鼠造血功能變化及恢復的程度。三組數(shù)據(jù)對比采用統(tǒng)計學T檢驗方法。結果第一部分:6例患者均順利植入,3個月時評價均為100%供者型,白細胞中位恢復時間12d,血小板中位恢復時間16d。移植過程順利,人臍帶來源的間充質干細胞輸注過程中患者無不良反應,無急性移植物抗宿主病(GVHD)發(fā)生,無其他嚴重并發(fā)癥發(fā)生。第二部分:我們通過貼壁培養(yǎng)法獲得的獲得人臍帶來源的間充質干細胞均呈貼壁生長的成纖維細胞樣形態(tài),表型特征分析顯示細胞為非造血細胞群,轉化試驗證明細胞具有體外成神經細胞和成脂肪能力,說明獲得的細胞符合MSC的特性。我們應用攜帶HGF基因的腺病毒載體(Ad-HGF)轉染間充質干細胞,通過檢測其表面標志及分化能力均不受影響。通免疫印跡法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測的轉染后間充質干細胞表達的較未轉染組HGF增高,差別有統(tǒng)計學意義。第三部分:3組試驗小鼠應用X線及化學藥物造模,在造模后發(fā)現(xiàn)小鼠活動減少,攝食減少、體重下降,試驗對照組1例死亡。造模后第8天,血常規(guī)檢測發(fā)現(xiàn),注射間充質干細胞2組小鼠白細胞、紅細胞、血小板下降均較實驗對照組輕,差別有統(tǒng)計學意義;Ad-HGF轉染MSC組較MSC組上述指標高,但無統(tǒng)計學差別。骨髓涂片及骨髓活檢均見造血組織減少、脂肪細胞增多現(xiàn)象。但Ad-HGF轉染MSC組及MSC組病理變化較實驗組輕。觀察至21天各組白細胞、紅細胞、血小板數(shù)量均處于低水平,但MSC組和Ad-HGF修飾MSC組恢復較好。結論第一部分:人臍帶來源的間充質干細胞聯(lián)合外周血干細胞共移植治療重型再生障礙性貧血安全無相關不良反應,造血恢復良好,急性GVHD發(fā)生率低。第二部分:貼壁培養(yǎng)方法獲得的人臍帶來源間充質干細胞經檢驗符合MSC的各項特征;攜帶HGF基因的腺病毒載體(Ad-HGF)轉染的間充質干細胞表面的各種標志的表達、轉化成其他細胞的功能等特征不受影響。第三部分:X線及環(huán)磷酰胺、氯霉素聯(lián)合構建小鼠再生障礙性貧血模型符合臨床再障特點,血常規(guī)及骨髓變化符合典型再障表現(xiàn)。實驗動物死亡率低。模型穩(wěn)定持久。人臍帶來源間充質干細胞及Ad-HGF修飾的人臍帶間充質干細胞對再障模型小鼠的造血功能均有保護作用,修飾后的間充質干細胞此保護作用略強,提示HGF與間充質干細胞對再障模型小鼠造血功能可能有協(xié)同作用,需進一步研究證實。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R556.5;R-332

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