【摘要】：研究背景致心律失常性右室心肌病(Arrhythmogenic Right Ventricular Cardiomyopathy, ARVC)是一種以心肌細(xì)胞逐漸被纖維脂肪細(xì)胞取代為特征,以右心室形態(tài)與功能異常為主,伴有心臟電生理改變的心肌疾病。臨床主要表現(xiàn)為室性心律失常或猝死。近50%的ARVC患者攜帶橋粒蛋白基因PKP2(plakophilin2)、DSG2(desmoglein2)、 DSC2 (desmocollin2)、DSP (desmoplakin)、JUP (PG, plakoglobulin)突變,因此該病也被稱為橋粒蛋白病。另外,非橋粒蛋白DES (desmin)、RYR2 (ryanodine receptor 2)、TMEM43 (transmembrane protein 43)、TGFβ3 (transforming growth factor-β)等基因的突變也被認(rèn)為與ARVC發(fā)生有關(guān)。由于該病的遺傳異質(zhì)性和表型多樣性,修飾基因和環(huán)境因素也在疾病表達(dá)過(guò)程中有著極其重要的作用。鑒于已知的致病基因突變并不能解釋所有ARVC的發(fā)生,因而我們推測(cè)還有新的ARVC致病基因及其他的致病機(jī)制未被發(fā)現(xiàn)。我們擬利用全外顯子組測(cè)序技術(shù)結(jié)合目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序技術(shù),尋找ARVC新的候選基因,并運(yùn)用分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)探索可能的分子發(fā)病機(jī)制,為尋找ARVC針對(duì)性的診療方案提供理論基礎(chǔ)。研究目的1)篩查ARVC的分子遺傳背景,尋找ARVC新的候選基因。2)研究突變基因的功能,探討其可能導(dǎo)致ARVC的致病機(jī)制,為疾病早期診斷及治療提供依據(jù)。研究方法及結(jié)果1) ARVC患者的臨床特點(diǎn)及病理特征我們?nèi)脒x的ARVC患者共25名,他們均為2006-2013年于我院心臟移植庫(kù)中診斷為ARVC,并進(jìn)行心臟移植的患者。其中男性18人,女性7人,平均年齡41.4±13.8歲。另外,有家族史的患者2人,散發(fā)病例23人。這些患者的臨床癥狀包括心悸、胸悶、呼吸困難等。對(duì)他們移植術(shù)后的心肌組織病理檢查發(fā)現(xiàn),病變心肌組織大部分被脂肪組織替代,同時(shí)伴有纖維化,但心肌細(xì)胞未見(jiàn)凋亡,這些病理表現(xiàn)尤以右室最為突出,另有3例患者表現(xiàn)為左室心肌受累。2)利用高通量測(cè)序技術(shù)篩查疾病候選基因選取六名典型患者進(jìn)行全外顯子組測(cè)序篩查基因背景,根據(jù)測(cè)序結(jié)果確定候選基因集,然后擴(kuò)大樣本至25例患者進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序,根據(jù)生物信息學(xué)分析及功能預(yù)測(cè)分析,得到致病基因突變結(jié)果和可能的候選致病基因,并進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。25例ARVC患者中,5例患者攜帶橋粒基因突變(DSG2,PKP2,DSP),1例患者攜帶細(xì)胞骨架蛋白基因突變(DES)。另外,10人攜帶與Hippo信號(hào)通路相關(guān)的基因FAT4突變、4人攜帶轉(zhuǎn)錄因子TBX家族的基因突變及4人攜帶核骨架蛋白基因SYNE1突變,我們推測(cè)這些基因突變可能與ARVC發(fā)生有關(guān)。3)突變基因的功能學(xué)研究及新的分子致病機(jī)制的探索用免疫組織化學(xué)技術(shù)及Western blot技術(shù)檢測(cè)致病基因編碼的相關(guān)蛋白的定位及表達(dá)變化。結(jié)果顯示,攜帶DSG2 p.F531C的患者心肌組織中,DSG2的定位與蛋白表達(dá)均異常；其中一名患者心肌組織中出現(xiàn)JUP及Cx43定位異常。細(xì)胞學(xué)水平的驗(yàn)證也表明,該變異影響了蛋白DSG2的定位及表達(dá)。攜帶DSG2 p.L797Q和DSP p.K1937M的患者心肌組織中,DSG2和DSP的定位及表達(dá)均無(wú)異常,其他閏盤(pán)蛋白的定位也沒(méi)有異常改變。而攜帶PKP2 (p.S249T和E808fsX30)的病變心肌組織中,PKP2的蛋白表達(dá)量顯著降低,蛋白JUP、Cx43及N-Cadhesion在閏盤(pán)的陽(yáng)性表達(dá)也有所下降。攜帶DES p.S12F的患者心肌組織中,desmin、JUP和Cx43的定位均異常。為進(jìn)一步研究疾病發(fā)病機(jī)制,我們用Western blot檢測(cè)病變心肌組織中RhoA酶活性及蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示,除了攜帶PKP2基因突變的心肌組織外,其他ARVC病變心肌組織中RhoA活性及蛋白表達(dá)水平均升高,同時(shí),縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)水平也升高。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在HL-1心肌細(xì)胞中,Cx43表達(dá)水平隨著RhoA酶活性升高而變化。結(jié)論ARVC是一種原發(fā)性遺傳性心肌病,疾病的發(fā)生發(fā)展與其遺傳背景密切相關(guān)。與既往研究一致,ARVC病變心肌組織呈現(xiàn)纖維化、脂肪化的病理改變,橋粒蛋白基因(DSG2、PKP2、DSP、DES)為該病的主要致病基因。此外,我們發(fā)現(xiàn),小G蛋白R(shí)hoA可能通過(guò)影響Cx43的表達(dá)參與了ARVC的疾病發(fā)生過(guò)程。在我們的研究中,雖然橋粒蛋白基因是該病主要的致病基因,但對(duì)ARVC患者的外顯子組測(cè)序數(shù)據(jù)分析顯示,還存在其它潛在致病基因,如FAT4、轉(zhuǎn)錄因子TBX家族及編碼核骨架蛋白的基因SYNE1的突變均可能與ARVC的疾病發(fā)生有關(guān)系。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R542.2

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本文編號(hào)：2424744