【摘要】：研究背景及目的血管內(nèi)皮功能受損是動脈粥樣硬化(AS)發(fā)生的始動環(huán)節(jié)。NO維持血管舒張功能、抑制血小板聚集、炎性反應,在調(diào)節(jié)血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。在內(nèi)皮細胞中,精氨酸酶Ⅱ (Arginase Ⅱ)可與內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)競爭其共同底物L-精氨酸,從而降低一氧化氮(NO)的生成。精氨酸酶Ⅱ是調(diào)節(jié)NO合成的重要的酶,而oxLDL可通過提高內(nèi)皮細胞中精氨酸酶Ⅱ的活性從而降低內(nèi)皮源性NO的生成,抑制精氨酸酶Ⅱ表達可有效的防止血管內(nèi)皮功能受損及動脈粥樣硬化病變的進展。但精氨酸酶Ⅱ的轉錄調(diào)控機制尚屬未知。多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1(PARP-1)是一類DNA修復酶,可以參與炎性反應并直接關系到細胞存活,影響動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展,還可發(fā)揮廣泛的基因轉錄調(diào)節(jié)作用。我們前期質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn),多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1(PARP-1)可作為轉錄因子特異性結合于精氨酸酶Ⅱ啟動子區(qū)域。而PARP-1能否參與調(diào)節(jié)精氨酸酶Ⅱ的活化及內(nèi)皮功能尚屬未知數(shù)。為此我們提出如下假設：1)抑制PARP-1可以降低內(nèi)皮源性的精氨酸酶Ⅱ表達,繼而影響eNOS的活性及NO的生成。2)PARP-1在調(diào)控精氨酸酶Ⅱ的表達及血管內(nèi)皮功能上發(fā)揮了重要作用�；谝陨纤悸�,本研究擬用熒光素酶報告、染色質(zhì)免疫共沉淀、蛋白免疫共沉淀等實驗技術,研究PARP-1在調(diào)控精氨酸酶Ⅱ表達中的作用及其機制,為PARP-1通過介導精氨酸酶Ⅱ影響內(nèi)皮功能提供實驗依據(jù)。材料與方法1質(zhì)粒構建及熒光素酶活性的檢測構建pGL3載體包含不同位點的精氨酸酶Ⅱ上游啟動子區(qū)域,轉染HAECs,熒光素酶報告系統(tǒng)篩選精氨酸酶Ⅱ核心啟動子區(qū)域。2細胞干預及處理不同濃度的oxLDL處理HAECs,同時轉染PARP-1小干擾RNA,收取細胞蛋白及mRNA進行蛋白印跡及RT-PCR檢測。3染色質(zhì)免疫沉淀試驗(ChIP)應用試劑盒(Millipore)進行染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)試驗。驗證PARP-1是否與精氨酸酶Ⅱ啟動子活性片段結合。4實時定量RT-PCRTrizol法抽提總RNA,檢測PARP-1、精氨酸酶Ⅱ等mRNA水平表達。5蛋白質(zhì)免疫印跡裂解液提取蛋白。SDS-PAGE電泳檢測PARP-1、精氨酸酶Ⅱ、eNOS等的表達。6免疫共沉淀為探討PARP-1與磷酸化的ERKl/2的相互作用,進行免疫共沉淀實驗。7動物實驗及標本檢測檢測ApoE-/- PARP-1+/+、ApoE-/-ARP-1-/-基因敲除小鼠血脂水平,測定主動脈組織及細胞NO含量、精氨酸酶活性,進行血管舒張試驗檢測內(nèi)皮舒張功能。8.免疫細胞化學及免疫組織化學檢測CD31、精氨酸酶Ⅱ及eNOS在HAECs及主動脈中的定位及表達。研究結果1多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1直接結合于精氨酸酶Ⅱ啟動子區(qū)域-774～-738bp位點將包含不同片段的精氨酸酶Ⅱ啟動子的pGL3載體轉染進HAECs細胞,并檢測熒光素酶活性表達,篩選出精氨酸酶Ⅱ啟動子核心區(qū)域定位于-774～-738bp。染色質(zhì)免疫共沉淀結果顯示,應用PARP-1抗體組-774--738bp區(qū)域可見擴增條帶,PARP-1特異性結合于精氨酸酶Ⅱ啟動子的-774～-738bp區(qū)域。2多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1調(diào)控主動脈內(nèi)皮細胞(HAECs)中精氨酸酶Ⅱ的基礎轉錄精氨酸酶Ⅱ的mRNA與蛋白表達可分別被PARP-1小干擾RNA抑制80%及75%;同時應用PARP-1過表達載體pcDNA3.1轉染到HAECs在過表達PARP-1的同時,可使精氨酸酶Ⅱ增加表達3倍左右。PARP-1作為轉錄因子參與精氨酸酶Ⅱ的基礎轉錄。3氧化低密度脂蛋白在體內(nèi)外均可上調(diào)多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1的表達oxLDL(50μg/ml)處理24h可使HAECs細胞中PARP-1蛋白表達較對照組提高4倍,PARP-1 mRNA水平的增高在oxLDL處理24h呈現(xiàn)劑量依賴性,最大效應出現(xiàn)在oxLDL 50μg/ml組,與對照組相比增高約3.54倍。HAECs中PARP-1 mRNA表達在50μg/ml的oxLDL刺激后0.5h即開始增加,并持續(xù)24h,表達最高水平在刺激后1小時出現(xiàn),約為對照組的4倍。共聚焦顯微鏡觀察到高膽固醇飲食喂養(yǎng)的小鼠主動脈內(nèi)皮PARP-1表達較正常飲食的小鼠增高3倍以上。同時,發(fā)生粥樣硬化的動脈較正常人主動脈其PARP-1表達也明顯升高。oxLDL在體內(nèi)外均能刺激PARP-1的生成。4多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1介導氧化低密度脂蛋白誘導的精氨酸酶Ⅱ表達并調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能高膽固醇飲食飼養(yǎng)的野生型小鼠主動脈精氨酸酶Ⅱ的表達較正常飲食者明顯升高,但PARP-1-/-小鼠主動脈的精氨酸酶Ⅱ的表達低于野生型小鼠,且與正常飲食的野生型小鼠相比并無差異。高脂飲食飼養(yǎng)的野生型小鼠主動脈eNOS表達較正常飲食者明顯降低,但高脂飲食下PARP-1-/-小鼠主動脈eNOS表達顯著高于野生型小鼠。正常飲食的野生型小鼠主動脈NO的產(chǎn)生顯著高于高脂飲食飼養(yǎng)者,而PARP-1-/-小鼠主動脈NO的產(chǎn)生顯著高于同樣接受高脂飲食飼養(yǎng)的野生型小鼠。同樣飲食喂養(yǎng)情況下(正�；蚋吣懝檀硷嬍�),PARP-1-/-小鼠主動脈環(huán)血管舒張性都顯著高于野生型小鼠。PARP-1通過調(diào)節(jié)精氨酸酶Ⅱ的生成而介導oxLDL抑制eNOS/NO表達。5氧化低密度脂蛋白通過磷酸化的ERK2與PARP-1相互作用上調(diào)精氨酸酶Ⅱ的表達PARP-1的表達在oxLDL刺激時可顯著增加,而MEKl/2磷酸化的抑制劑PD98059、ERK1/2磷酸化的抑制劑U0126均可抑制PARP-1的表達。在應用抗PARP-1的抗體進行免疫沉淀所得的蛋白中可檢測到磷酸化的ERK2,而且oxLDL刺激組遠高于相應的對照組。蛋白印跡檢測結果顯示,MEKl/2磷酸化的抑制劑PD98059、ERK1/2磷酸化的抑制劑U0126以及PARP-1抑制劑DPQ處理均可顯著降低精氨酸酶Ⅱ的表達。6 oxLDL增強PARP-1與肌球蛋白Myosin相互作用并調(diào)控精氨酸酶Ⅱ的表達質(zhì)譜分析與PARP-1相互作用的蛋白,并用免疫共沉淀證實檢測到Myosin可以與RARP-1相互作用。OxLDL刺激后HAECs肌球蛋白Myosim表達明顯增多,較對照組升高4.37倍。免疫組化顯示,RARP-1和肌球蛋白Myosin共定位于血管內(nèi)皮,且人動脈粥樣硬化的動脈比正常的動脈表達更多。小鼠體內(nèi)高膽固醇飲食也可誘使主動脈肌球蛋白Myosin表達明顯增多。PARP-1敲除小鼠較野生型小鼠主動脈內(nèi)皮中肌球蛋白Myosin的表達明顯降低。7 oxLDL通過PARP-1-myosin復合物介導染色質(zhì)重塑上調(diào)精氨酸酶Ⅱ表達組蛋白2A經(jīng)氧化低密度脂蛋白刺激后乙�；鰪�,而PARP-1小干擾RNA處理組可促使其脫乙�；�。C9873,組蛋白乙酰轉移酶抑制劑,可以抑制組蛋白2A的乙�；M而抑制精氨酸酶Ⅱ表達,顯著逆轉氧化低密度脂蛋白引起的精氨酸酶Ⅱ高表達。肌球蛋白myosm抑制劑ML-7干預主動脈內(nèi)皮細胞,能逆轉由氧化低密度脂蛋白刺激誘導的乙�；M蛋白H2A的高表達。肌球蛋白myosin抑制劑也可逆轉由氧化低密度脂蛋白刺激誘導的內(nèi)皮細胞精氨酸酶Ⅱ高表達。結論1 RARP-1可作為轉錄因子特異性結合于精氨酸酶Ⅱ啟動子區(qū)域。2抑制RARP-1可以降低內(nèi)皮源性的精氨酸酶Ⅱ表達,增加eNOS的活性及NO的生成。3 oxLDL可以通過磷酸化的ERK2向核內(nèi)遷移并直接作用于PARR-1,繼而活化精氨酸酶Ⅱ的轉錄。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R54

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本文編號：2399802