【摘要】：研究背景及目的血管內(nèi)皮功能受損是動脈粥樣硬化(AS)發(fā)生的始動環(huán)節(jié)。NO維持血管舒張功能、抑制血小板聚集、炎性反應(yīng),在調(diào)節(jié)血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。在內(nèi)皮細(xì)胞中,精氨酸酶Ⅱ (Arginase Ⅱ)可與內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)競爭其共同底物L(fēng)-精氨酸,從而降低一氧化氮(NO)的生成。精氨酸酶Ⅱ是調(diào)節(jié)NO合成的重要的酶,而oxLDL可通過提高內(nèi)皮細(xì)胞中精氨酸酶Ⅱ的活性從而降低內(nèi)皮源性NO的生成,抑制精氨酸酶Ⅱ表達(dá)可有效的防止血管內(nèi)皮功能受損及動脈粥樣硬化病變的進(jìn)展。但精氨酸酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制尚屬未知。多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1(PARP-1)是一類DNA修復(fù)酶,可以參與炎性反應(yīng)并直接關(guān)系到細(xì)胞存活,影響動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展,還可發(fā)揮廣泛的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。我們前期質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn),多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1(PARP-1)可作為轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合于精氨酸酶Ⅱ啟動子區(qū)域。而PARP-1能否參與調(diào)節(jié)精氨酸酶Ⅱ的活化及內(nèi)皮功能尚屬未知數(shù)。為此我們提出如下假設(shè)：1)抑制PARP-1可以降低內(nèi)皮源性的精氨酸酶Ⅱ表達(dá),繼而影響eNOS的活性及NO的生成。2)PARP-1在調(diào)控精氨酸酶Ⅱ的表達(dá)及血管內(nèi)皮功能上發(fā)揮了重要作用�；谝陨纤悸�,本研究擬用熒光素酶報(bào)告、染色質(zhì)免疫共沉淀、蛋白免疫共沉淀等實(shí)驗(yàn)技術(shù),研究PARP-1在調(diào)控精氨酸酶Ⅱ表達(dá)中的作用及其機(jī)制,為PARP-1通過介導(dǎo)精氨酸酶Ⅱ影響內(nèi)皮功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。材料與方法1質(zhì)粒構(gòu)建及熒光素酶活性的檢測構(gòu)建pGL3載體包含不同位點(diǎn)的精氨酸酶Ⅱ上游啟動子區(qū)域,轉(zhuǎn)染HAECs,熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)篩選精氨酸酶Ⅱ核心啟動子區(qū)域。2細(xì)胞干預(yù)及處理不同濃度的oxLDL處理HAECs,同時(shí)轉(zhuǎn)染PARP-1小干擾RNA,收取細(xì)胞蛋白及mRNA進(jìn)行蛋白印跡及RT-PCR檢測。3染色質(zhì)免疫沉淀試驗(yàn)(ChIP)應(yīng)用試劑盒(Millipore)進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)試驗(yàn)。驗(yàn)證PARP-1是否與精氨酸酶Ⅱ啟動子活性片段結(jié)合。4實(shí)時(shí)定量RT-PCRTrizol法抽提總RNA,檢測PARP-1、精氨酸酶Ⅱ等mRNA水平表達(dá)。5蛋白質(zhì)免疫印跡裂解液提取蛋白。SDS-PAGE電泳檢測PARP-1、精氨酸酶Ⅱ、eNOS等的表達(dá)。6免疫共沉淀為探討PARP-1與磷酸化的ERKl/2的相互作用,進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。7動物實(shí)驗(yàn)及標(biāo)本檢測檢測ApoE-/- PARP-1+/+、ApoE-/-ARP-1-/-基因敲除小鼠血脂水平,測定主動脈組織及細(xì)胞NO含量、精氨酸酶活性,進(jìn)行血管舒張?jiān)囼?yàn)檢測內(nèi)皮舒張功能。8.免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫組織化學(xué)檢測CD31、精氨酸酶Ⅱ及eNOS在HAECs及主動脈中的定位及表達(dá)。研究結(jié)果1多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1直接結(jié)合于精氨酸酶Ⅱ啟動子區(qū)域-774～-738bp位點(diǎn)將包含不同片段的精氨酸酶Ⅱ啟動子的pGL3載體轉(zhuǎn)染進(jìn)HAECs細(xì)胞,并檢測熒光素酶活性表達(dá),篩選出精氨酸酶Ⅱ啟動子核心區(qū)域定位于-774～-738bp。染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示,應(yīng)用PARP-1抗體組-774--738bp區(qū)域可見擴(kuò)增條帶,PARP-1特異性結(jié)合于精氨酸酶Ⅱ啟動子的-774～-738bp區(qū)域。2多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1調(diào)控主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAECs)中精氨酸酶Ⅱ的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄精氨酸酶Ⅱ的mRNA與蛋白表達(dá)可分別被PARP-1小干擾RNA抑制80%及75%;同時(shí)應(yīng)用PARP-1過表達(dá)載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染到HAECs在過表達(dá)PARP-1的同時(shí),可使精氨酸酶Ⅱ增加表達(dá)3倍左右。PARP-1作為轉(zhuǎn)錄因子參與精氨酸酶Ⅱ的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄。3氧化低密度脂蛋白在體內(nèi)外均可上調(diào)多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1的表達(dá)oxLDL(50μg/ml)處理24h可使HAECs細(xì)胞中PARP-1蛋白表達(dá)較對照組提高4倍,PARP-1 mRNA水平的增高在oxLDL處理24h呈現(xiàn)劑量依賴性,最大效應(yīng)出現(xiàn)在oxLDL 50μg/ml組,與對照組相比增高約3.54倍。HAECs中PARP-1 mRNA表達(dá)在50μg/ml的oxLDL刺激后0.5h即開始增加,并持續(xù)24h,表達(dá)最高水平在刺激后1小時(shí)出現(xiàn),約為對照組的4倍。共聚焦顯微鏡觀察到高膽固醇飲食喂養(yǎng)的小鼠主動脈內(nèi)皮PARP-1表達(dá)較正常飲食的小鼠增高3倍以上。同時(shí),發(fā)生粥樣硬化的動脈較正常人主動脈其PARP-1表達(dá)也明顯升高。oxLDL在體內(nèi)外均能刺激PARP-1的生成。4多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1介導(dǎo)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的精氨酸酶Ⅱ表達(dá)并調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能高膽固醇飲食飼養(yǎng)的野生型小鼠主動脈精氨酸酶Ⅱ的表達(dá)較正常飲食者明顯升高,但PARP-1-/-小鼠主動脈的精氨酸酶Ⅱ的表達(dá)低于野生型小鼠,且與正常飲食的野生型小鼠相比并無差異。高脂飲食飼養(yǎng)的野生型小鼠主動脈eNOS表達(dá)較正常飲食者明顯降低,但高脂飲食下PARP-1-/-小鼠主動脈eNOS表達(dá)顯著高于野生型小鼠。正常飲食的野生型小鼠主動脈NO的產(chǎn)生顯著高于高脂飲食飼養(yǎng)者,而PARP-1-/-小鼠主動脈NO的產(chǎn)生顯著高于同樣接受高脂飲食飼養(yǎng)的野生型小鼠。同樣飲食喂養(yǎng)情況下(正�；蚋吣懝檀硷嬍�),PARP-1-/-小鼠主動脈環(huán)血管舒張性都顯著高于野生型小鼠。PARP-1通過調(diào)節(jié)精氨酸酶Ⅱ的生成而介導(dǎo)oxLDL抑制eNOS/NO表達(dá)。5氧化低密度脂蛋白通過磷酸化的ERK2與PARP-1相互作用上調(diào)精氨酸酶Ⅱ的表達(dá)PARP-1的表達(dá)在oxLDL刺激時(shí)可顯著增加,而MEKl/2磷酸化的抑制劑PD98059、ERK1/2磷酸化的抑制劑U0126均可抑制PARP-1的表達(dá)。在應(yīng)用抗PARP-1的抗體進(jìn)行免疫沉淀所得的蛋白中可檢測到磷酸化的ERK2,而且oxLDL刺激組遠(yuǎn)高于相應(yīng)的對照組。蛋白印跡檢測結(jié)果顯示,MEKl/2磷酸化的抑制劑PD98059、ERK1/2磷酸化的抑制劑U0126以及PARP-1抑制劑DPQ處理均可顯著降低精氨酸酶Ⅱ的表達(dá)。6 oxLDL增強(qiáng)PARP-1與肌球蛋白Myosin相互作用并調(diào)控精氨酸酶Ⅱ的表達(dá)質(zhì)譜分析與PARP-1相互作用的蛋白,并用免疫共沉淀證實(shí)檢測到Myosin可以與RARP-1相互作用。OxLDL刺激后HAECs肌球蛋白Myosim表達(dá)明顯增多,較對照組升高4.37倍。免疫組化顯示,RARP-1和肌球蛋白Myosin共定位于血管內(nèi)皮,且人動脈粥樣硬化的動脈比正常的動脈表達(dá)更多。小鼠體內(nèi)高膽固醇飲食也可誘使主動脈肌球蛋白Myosin表達(dá)明顯增多。PARP-1敲除小鼠較野生型小鼠主動脈內(nèi)皮中肌球蛋白Myosin的表達(dá)明顯降低。7 oxLDL通過PARP-1-myosin復(fù)合物介導(dǎo)染色質(zhì)重塑上調(diào)精氨酸酶Ⅱ表達(dá)組蛋白2A經(jīng)氧化低密度脂蛋白刺激后乙酰化增強(qiáng),而PARP-1小干擾RNA處理組可促使其脫乙�；�。C9873,組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑,可以抑制組蛋白2A的乙酰化進(jìn)而抑制精氨酸酶Ⅱ表達(dá),顯著逆轉(zhuǎn)氧化低密度脂蛋白引起的精氨酸酶Ⅱ高表達(dá)。肌球蛋白myosm抑制劑ML-7干預(yù)主動脈內(nèi)皮細(xì)胞,能逆轉(zhuǎn)由氧化低密度脂蛋白刺激誘導(dǎo)的乙�；M蛋白H2A的高表達(dá)。肌球蛋白myosin抑制劑也可逆轉(zhuǎn)由氧化低密度脂蛋白刺激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞精氨酸酶Ⅱ高表達(dá)。結(jié)論1 RARP-1可作為轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合于精氨酸酶Ⅱ啟動子區(qū)域。2抑制RARP-1可以降低內(nèi)皮源性的精氨酸酶Ⅱ表達(dá),增加eNOS的活性及NO的生成。3 oxLDL可以通過磷酸化的ERK2向核內(nèi)遷移并直接作用于PARR-1,繼而活化精氨酸酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R54

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本文編號：2399802