【摘要】：病毒性心臟病(viral heart disease, VHD)是與病毒感染有關(guān)的一組心血管疾病,包括病毒性心肌炎(viral myocarditis, VMC)和擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM),其最常見的感染原是柯薩奇病毒(coxsackie virusB,CVB)。據(jù)報(bào)道,由于病毒感染持續(xù)存在或自身免疫失穩(wěn)等原因,少數(shù)患者可由VMC進(jìn)展為慢性病毒性心肌炎和DCM。很多學(xué)者認(rèn)為VMC和DCM實(shí)際上是同一種疾病的不同階段。近期的研究表明心肌纖維化是VMC進(jìn)展至DCM的重要原因,但其機(jī)制至今尚未能完全闡明。Th22細(xì)胞是一種新發(fā)現(xiàn)的CD4+T輔助細(xì)胞亞群,其特征是分泌白介素-22(interleukin-22, IL-22),而不分泌白介素-17、白介素-4或干擾素-Y(interferon-y, INF-y)等因子。近來的多項(xiàng)研究表明,分泌IL-22的Th22細(xì)胞參與了多種自身免疫性及感染性疾病發(fā)生和發(fā)展的病理生理機(jī)制。我們課題組前期的實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn),Th22細(xì)胞及IL-22在病毒性心肌炎中起到了抗感染與抗病毒的作用。但Th22及其分泌的IL-22是否參與了VMC向DCM進(jìn)展的過程?其在心肌纖維化的進(jìn)程中究竟扮演著什么樣的角色?又是通過哪些因子發(fā)揮作用的?目前知之甚少。為了解Th22及IL-22是否參與VMC向DCM進(jìn)展的過程,闡明其在心肌纖維化中的作用,尋求治療DCM的新思路和新靶點(diǎn),本課題將應(yīng)用BALB/c小鼠腹腔內(nèi)注射CVB3病毒的方法建立VHD模型,進(jìn)行以下的研究。第一部分：小鼠病毒性心臟病各階段心肌纖維化相關(guān)指標(biāo)的變化本部分包括以下兩個(gè)方面的研究：1.小鼠病毒性心臟病模型的建立及心肌病理改變；2.小鼠病毒性心臟病各階段纖維化相關(guān)指標(biāo)變化。100只4周齡雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為急性病毒性心肌炎(acute viral myocarditis, AVMC)組(n=20)、慢性病毒性心肌炎(chronic myocarditis)組(n=20)、DCM組(n=30)及對照組(n=30)。采用腹腔接種CVB3建立小鼠AVMC模型、慢性病毒性心肌炎模型及DCM模型,對照組小鼠腹腔注射等量的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)。各組小鼠在規(guī)定時(shí)點(diǎn)取血,分離血漿,無菌取心臟和脾。HE染色了解心肌病理組織學(xué)改變,Masson染色了解心肌纖維化程度,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time RT-PCR)檢測心肌組織纖維化相關(guān)指標(biāo)Ⅰ型膠原A1 (collagen type Ⅰ-Al, COL1-A1)、Ⅲ型膠原A1 (collagen type Ⅲ-A1, COL3-A1)、基質(zhì)金屬蛋白酶9 (matrix metalloproteinase-9, MMP9)及金屬蛋白酶組織抑制因子1 (tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1) mRNA的表達(dá)；酶聯(lián)免疫雙夾心抗體法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測血清中纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)。大體標(biāo)本顯示AVMC小鼠心室大小無變化；慢性病毒性心肌炎小鼠心腔無明顯擴(kuò)大,但可見少量片狀纖維化病灶；DCM小鼠左室腔明顯擴(kuò)大,室壁變薄。病理切片蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色顯示AVMC小鼠心肌纖維斷裂、心肌細(xì)胞變性壞死、間質(zhì)有大量炎癥性細(xì)胞浸潤,有心肌纖維化發(fā)生,但僅局限在心肌壞死灶周邊；慢性病毒性心肌炎小鼠無明顯心肌纖維斷裂,心肌內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤減少,心肌間質(zhì)纖維化明顯；DCM小鼠心肌間質(zhì)大量膠原異常增生,呈彌漫性分布而幾無炎性細(xì)胞浸潤,心肌間質(zhì)纖維化較慢性期更為明顯。心肌組織切片Masson染色顯示,心肌纖維化程度進(jìn)行性增加,各階段膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction, CVF)的變化有顯著性差異。同時(shí)外周血ELISA及心肌組織RT-PCR顯示與同時(shí)點(diǎn)對照組相比,AVMC組、慢性病毒性心肌炎組及DCM組纖維化相關(guān)指標(biāo)COL1-A1、COL3-A1、MMP9呈升高趨勢,MMP9相關(guān)抑制因子TIMP-1呈降低趨勢。結(jié)論：AVMC、慢性病毒性心肌炎及DCM造模成功,隨VHD病情進(jìn)展,心肌纖維化程度呈進(jìn)行性加重。第二部分：Th22細(xì)胞及其分泌的相關(guān)細(xì)胞因子IL-22在VHD中的表達(dá)本部分包含以下兩個(gè)方面的研究：1.小鼠VHD演變過程中Th22細(xì)胞亞群的變化趨勢;2.小鼠VHD演變過程中Th22分泌的相關(guān)因子IL-22 IL-22受體(IL-22 receptor, IL-22R)的表達(dá)變化趨勢。各組小鼠在規(guī)定時(shí)點(diǎn)無菌取血,分離血清,無菌取心臟和脾。流式細(xì)胞儀(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS)檢測小鼠脾Th22細(xì)胞數(shù)量百分比。ELISA檢測血清中IL-22蛋白的表達(dá)；免疫組化檢測小鼠心肌組織IL-22R表達(dá)水平。使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS對各組小鼠脾臟Th22細(xì)胞與IL-22、IL-22R進(jìn)行相關(guān)性分析。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,與同時(shí)點(diǎn)對照組小鼠相比,VHD小鼠Th22細(xì)胞百分比顯著升高(AVMC期：4.64±2.35 vs. control 1.78±0.79;慢性病毒性心肌炎期：5.90±1.74 vs. control 1.50±0.44; DCM期：5.60±1.47 vs. control 1.75±0.30)。 ELISA結(jié)果顯示,VHD小鼠血清IL-22蛋白含量較同時(shí)點(diǎn)對照組明顯升高(AVMC期：18.07±3.22 vs. control 14.23±1.4 pg/ml;'慢性病毒性心肌炎期：23.66±2.93 vs. control 15.89±1.92 pg/ml; DCM期：23.48±4.95 vs.control 16.09±2.2 pg/ml)。免疫組化結(jié)果顯示,VHD小鼠心肌組織IL-22R較同時(shí)點(diǎn)對照組明顯升高(IL-22R IOD值在AVMC期：32.21±2.81×105 vs.control 6.30±1.03×105;慢性病毒性心肌炎期：30.65±6.76×105 vs. control5.15±0.99×105；DCM期：34.40±2.63×105 vs. control 5.48±1.53x105)。相關(guān)性分析顯示,Th22細(xì)胞數(shù)量與IL-22 ± IL-22R呈正相關(guān)。結(jié)論：Th22細(xì)胞比例及其相關(guān)因子循環(huán)血清IL-22、心肌IL-22R蛋白表達(dá)在AVMC組、慢性病毒性心肌炎組及DCM組均較同時(shí)點(diǎn)對照組增高,且Th22細(xì)胞百分比與循環(huán)血清IL-22、心肌IL-22R蛋白表達(dá)存在正相關(guān),提示Th22細(xì)胞及其相關(guān)因子參與了小鼠VHD的演變過程。第三部分：抗IL-22抗體對小鼠病毒性心肌炎心肌纖維化的干預(yù)作用該部分包含以下三個(gè)方面的研究：1.抗IL-22抗體(anti-IL-22 antibody, Anti-IL-22 Ab)對病毒性心肌炎小鼠Th22細(xì)胞、IL-22、IL-22R表達(dá)的影響；2.抗IL-22抗體對病毒性心肌炎小鼠及其心肌病理變化的影響；3.抗IL-22抗體對病毒性心肌炎小鼠心肌纖維化及其相關(guān)指標(biāo)的影響。4周齡雄性BABL/c小鼠60只,隨機(jī)分成week 2組(n=30)及week 12組(n=30),每組中又分成三個(gè)亞組：抗IL-22抗體組(Anti-IL-22 Ab組,n=10)、同型對照組(IgG組,n=10)、PBS組(n=10)。全部小鼠均腹腔注射CVB3病毒液,注射病毒當(dāng)天定義為第0天。week 2組中Anti-IL-22 Ab、IgG和PBS亞組小鼠在第0天分別腹腔注射50μg Anti-IL-22 Ab、50μg同型對照IgG和50μg PBS; week 12組中的三個(gè)亞組存活小鼠尚需在第28天及第56天注射CVB病毒液,其三個(gè)亞組的存活小鼠需在第0天、第28天、第56天分別腹腔注射50μg Anti-IL-22 Ab、50μg同型對照IgG和50μgPBS。各組小鼠在規(guī)定時(shí)點(diǎn)取血,分離血清,無菌取心臟和脾。Masson染色了解心肌纖維化程度；流式細(xì)胞技術(shù)檢測脾Th22亞群細(xì)胞數(shù)量；免疫組織化學(xué)檢測小鼠心肌組織IL-22R表達(dá)水平；RT-PCR檢測小鼠心肌組織中COL1-A1 COL3-A1、MMP9、TIMP-1 mRNA的表達(dá)；ELISA檢測小鼠血漿中TL-22、COL1-A1、MMP9、TIMP-1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與注射同型對照IgG或PBS相比,不論在急性或慢性病毒性心肌炎期,Anti-IL-22 Ab可減少CVB3病毒感染小鼠脾臟Th22細(xì)胞、血清中IL-22水平及心肌中IL-22R的含量,增加小鼠的死亡率,升高心肌及血清中心肌纖維化相關(guān)指標(biāo)的mRNA及蛋白水平,加劇小鼠心肌的纖維化程度,使抗體干預(yù)后慢性病毒性心肌炎期小鼠的心肌纖維化程度更趨于接近抗體未干預(yù)時(shí)的DCM期(CVF 0.30±0.07 vs.0.24±0.09, p0.05),加速心肌纖維化病程的進(jìn)展。結(jié)論：通過Anti-IL-22 Ab的拮抗作用,我們可以觀察到隨著Th22細(xì)胞百分比、血清IL-22、心肌組織IL-22R的降低,AVMC及慢性病毒性心肌炎小鼠生存率明顯降低,心肌纖維化進(jìn)程加快,而且抗體干預(yù)后的小鼠在慢性病毒性心肌炎期的心肌纖維化程度已與未干預(yù)時(shí)的DCM期相當(dāng),與之相伴的是纖維化相關(guān)因子COL1-A1、COL3-A1、MMP9的增加及TIMP-1的降低。該結(jié)果提示分泌IL-22的Th22細(xì)胞通過對心肌纖維化相關(guān)因子的干預(yù),在VHD進(jìn)程中起到延緩心肌纖維化和保護(hù)心肌的作用�？傊�,分泌IL-22的Th22細(xì)胞是AVMC向慢性病毒性心肌炎甚至DCM發(fā)展過程中的重要細(xì)胞,它通過抑制纖維化相關(guān)指標(biāo),延緩心肌纖維化進(jìn)程,發(fā)揮保護(hù)心肌的重要作用。本課題研究結(jié)果提示：CVB3導(dǎo)致的小鼠VHD模型中,隨病情進(jìn)展,心肌纖維化程度呈進(jìn)行性加重。小鼠Th22細(xì)胞及其相關(guān)因子IL-22、IL-22R在AVMC、慢性病毒性心肌炎期及DCM期均較同時(shí)點(diǎn)對照組增高,且Th22細(xì)胞數(shù)與IL-22、IL-22R存在正相關(guān),提示Th22細(xì)胞及其相關(guān)因子參與小鼠VMC向DCM演變的過程。分泌IL-22的Th22細(xì)胞是AVMC向慢性病毒性心肌炎甚至DCM發(fā)展過程中的重要細(xì)胞,它通過抑制纖維化相關(guān)指標(biāo),延緩心肌纖維化進(jìn)程,發(fā)揮保護(hù)心肌的重要作用。本課題研究數(shù)據(jù)提示IL-22可能是通過作用于心肌纖維化達(dá)到延緩或阻止AVMC向慢性病毒性心肌炎甚至DCM發(fā)展的重要靶標(biāo)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R541

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本文編號：2398274