【摘要】：目的心房顫動(dòng)(房顫)是臨床上最常見的心律失常之一,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣,目前尚無確定的闡明其病理生理機(jī)制,本研究采用自發(fā)性房顫轉(zhuǎn)基因小鼠模型,研究小鼠心房肌細(xì)胞相關(guān)離子通道電流的改變,為進(jìn)一步闡明房顫的發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。方法本研究實(shí)驗(yàn)組為自發(fā)性房顫轉(zhuǎn)基因小鼠模型,對(duì)照組為同齡野生型普通C57BL/6小鼠；采用VisualSonics Vevo770高分辨率小動(dòng)物超聲系統(tǒng)對(duì)小鼠行心臟超聲檢測(cè)；采用PCLAB-UE生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄小鼠的心電圖數(shù)據(jù)；采用改良的Langendorff灌流裝置、二步消化法來急性分離小鼠心房肌細(xì)胞；采用標(biāo)準(zhǔn)的全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄動(dòng)作電位和離子通道電流(瞬時(shí)外向鉀電流Ito、內(nèi)向整流鉀通道IK1和起搏電流If)。結(jié)果心臟超聲數(shù)據(jù)顯示,野生型小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟結(jié)構(gòu)和功能未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。體表心電圖數(shù)據(jù)顯示,相比于野生型小鼠,轉(zhuǎn)基因小鼠基礎(chǔ)心率偏慢(轉(zhuǎn)基因小鼠：391±61次/分；野生型小鼠：436±50次/分,p=0.048),轉(zhuǎn)基因小鼠QT間期較野生型小鼠的偏長(zhǎng)(42.3±8.6ms比34.2±8.6ms,p=0.02),但用心率校正后得到QTc,二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(34±6.8ms比29.1±7.1ms,p=0.076)。膜片鉗記錄結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠的單個(gè)心房肌細(xì)胞動(dòng)作電位AP近似于三角形,其復(fù)極較快,二者靜息電位未見明顯差異(轉(zhuǎn)基因小鼠：-67.9±5.0mV；野生型小鼠-65.3±4.2mV,p=0.350), APD未見明顯差異(59.1±14.3ms比46.0±12ms,p=0.082),其中APD20 (4.8±0.5ms比4.9±0.8ms,p=0.837)、APD50 (7.3±4.6ms比9.6±4.5ms,p=0.370)、APD90 (29.2±8.8ms比25.6±8.2ms,p=0.437)比較均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在離子通道電流方面：Ito電流,轉(zhuǎn)基因小鼠的峰值較野生型小鼠的峰值稍低,從-30mV～+70mV二者電流密度均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,在70mV的電流密度(野生型小鼠：12.2±0.6pA/pF;轉(zhuǎn)基因小鼠11.0±0.7pA/pF, p=0.036),但在通道動(dòng)力學(xué)方面,即穩(wěn)態(tài)啟動(dòng)曲線在二者并無差異；IK1電流,野生型小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠心房肌細(xì)胞的未見明顯差異；If電流,轉(zhuǎn)基因小鼠的電流峰值較野生型小鼠的電流幅度明顯增大,尾電流(-40mV引出)也明顯增大,從-70mV～-170mV二者電流密度均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,在-170mV的電流密度(野生型小鼠：-26.9±3.0pA/pF;轉(zhuǎn)基因小鼠：-39.6±4.6pA/pF,p0.001),轉(zhuǎn)基因小鼠的穩(wěn)態(tài)激活曲線明顯右移,Boltzmann方程擬合得到半激活電壓(Vi/2)和斜率因子k,野生型小鼠V1/2為-128.2士1.65mV,而轉(zhuǎn)基因小鼠為-109.45±1.35mV(p0.05),野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠的k分別為13.91±0.98mV和14.41±0.78mV(p=0.58)。結(jié)論轉(zhuǎn)基因房顫小鼠和野生型小鼠相比,二者的心臟結(jié)構(gòu)和功能無明顯差異；轉(zhuǎn)基因房顫小鼠比野生型小鼠的心率稍慢,相應(yīng)的QT間期略長(zhǎng),但經(jīng)心率校正后的QTc在二者間并無差異；轉(zhuǎn)基因房顫小鼠和野生型小鼠的心房肌細(xì)胞的電生理特性即動(dòng)作電位的特點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)明顯差異；離子通道電流方面,轉(zhuǎn)基因房顫小鼠心房肌細(xì)胞的Ito電流較野生型小鼠的略減弱,但通道動(dòng)力學(xué)方面并無差異；IK1電流在二者的心房肌細(xì)胞中無差異；轉(zhuǎn)基因房顫小鼠心房肌細(xì)胞的If電流密度明顯大于野生型小鼠,且心房肌細(xì)胞的If電流更容易激活,提示起搏電流可能參與了房顫的某種發(fā)生機(jī)制。p0.001),轉(zhuǎn)基因小鼠的穩(wěn)態(tài)激活曲線明顯右移,Boltzmann方程擬合得到半激活電壓(Vi/2)和斜率因子k,野生型小鼠V1/2為-128.2士1.65mV,而轉(zhuǎn)基因小鼠為-109.45±1.35mV(p0.05),野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠的k分別為13.91±0.98mV和14.41±0.78mV(p=0.58)。結(jié)論轉(zhuǎn)基因房顫小鼠和野生型小鼠相比,二者的心臟結(jié)構(gòu)和功能無明顯差異；轉(zhuǎn)基因房顫小鼠比野生型小鼠的心率稍慢,相應(yīng)的QT間期略長(zhǎng),但經(jīng)心率校正后的QTc在二者間并無差異；轉(zhuǎn)基因房顫小鼠和野生型小鼠的心房肌細(xì)胞的電生理特性即動(dòng)作電位的特點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)明顯差異；離子通道電流方面,轉(zhuǎn)基因房顫小鼠心房肌細(xì)胞的Ito電流較野生型小鼠的略減弱,但通道動(dòng)力學(xué)方面并無差異；IK1電流在二者的心房肌細(xì)胞中無差異；轉(zhuǎn)基因房顫小鼠心房肌細(xì)胞的If電流密度明顯大于野生型小鼠,且心房肌細(xì)胞的If電流更容易激活,提示起搏電流可能參與了房顫的某種發(fā)生機(jī)制。目的心房顫動(dòng)(簡(jiǎn)稱房顫)的電生理特性改變的基礎(chǔ)在于心房肌細(xì)胞的離子通道改變,離子通道蛋白是房顫的關(guān)鍵分子底物。本研究采用自發(fā)性房顫轉(zhuǎn)基因小鼠模型,研究小鼠心房肌組織相關(guān)離子通道表達(dá)的改變,為闡明房顫的發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。方法本研究實(shí)驗(yàn)組為自發(fā)性房顫轉(zhuǎn)基因小鼠模型,對(duì)照組為同齡野生型普通C57BL/6小鼠；采用RT-PCR方法檢測(cè)小鼠心房肌組織HCN通道m(xù)RNA (HCN2和HCN4)改變情況；采用Western-Blot方法檢測(cè)小鼠心房肌組織HCN通道蛋白(HCN2和HCN4)及Kv4蛋白(Kv4.2和Kv4.3)的改變情況。結(jié)果轉(zhuǎn)基因房顫小鼠心房肌組織的HCN2 mRNA相對(duì)表達(dá)(HCN2/GAPDH)明顯高于野生型小鼠(1.10±0.40,N=6比0.36±0.17,N=6,p0.01)；同樣,HCN4 mRNA的在轉(zhuǎn)基因小鼠的心房肌組織中表達(dá)顯著高于野生型小鼠(1.48±0.63,N=6比0.52±0.11, N=6,p0.01); WB結(jié)果顯示HCN2蛋白在野生型小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠心房肌組織中差異不明顯,而HCN4蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)明顯高于野生型普通小鼠,經(jīng)過蛋白條帶灰度值分析,得出轉(zhuǎn)基因小鼠心房肌組織HCN2的相對(duì)表達(dá)量為0.034±0.010,野生型小鼠為0.035±0.017 (p=1.00); HCN4蛋白的相對(duì)表達(dá)量二者中有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0.088±0.054比0.014±4±0.009,p=0.029)。Kv4.2和Kv4.3在野生型小鼠的表達(dá)明顯高于轉(zhuǎn)基因小鼠,Kv4.2蛋白在野生型小鼠心房肌組織中的表達(dá)明顯高于轉(zhuǎn)基因小鼠(0.68±0.26比0.27±0.22,N=6,p=0.015),同樣,Kv4.3蛋白在野生型小鼠心房肌組織中的表達(dá)亦明顯高于轉(zhuǎn)基因小鼠(1.04±0.13比0.23±±±0.08,N=6,p=0.002)。結(jié)論轉(zhuǎn)基因房顫小鼠心房肌組織的HCN2和HCN4 mRNA相對(duì)表達(dá)顯著高于野生型小鼠；轉(zhuǎn)基因小鼠心房肌組織的HCN4蛋白水平相對(duì)表達(dá)顯著高于野生型小鼠；轉(zhuǎn)基因小鼠心房肌組織的Kv 4.2和Kv 4.3蛋白水平相對(duì)表達(dá)顯著低于野生型小鼠。中有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0.088±0.054比0.014±4±0.009,p=0.029)。Kv4.2和Kv4.3在野生型小鼠的表達(dá)明顯高于轉(zhuǎn)基因小鼠,Kv4.2蛋白在野生型小鼠心房肌組織中的表達(dá)明顯高于轉(zhuǎn)基因小鼠(0.68±0.26比0.27±0.22,N=6,p=0.015),同樣,Kv4.3蛋白在野生型小鼠心房肌組織中的表達(dá)亦明顯高于轉(zhuǎn)基因小鼠(1.04±0.13比0.23±±±0.08,N=6,p=0.002)。結(jié)論轉(zhuǎn)基因房顫小鼠心房肌組織的HCN2和HCN4 mRNA相對(duì)表達(dá)顯著高于野生型小鼠；轉(zhuǎn)基因小鼠心房肌組織的HCN4蛋白水平相對(duì)表達(dá)顯著高于野生型小鼠；轉(zhuǎn)基因小鼠心房肌組織的Kv 4.2和Kv 4.3蛋白水平相對(duì)表達(dá)顯著低于野生型小鼠。目的近年來的研究發(fā)現(xiàn)起搏電流參與了房顫的發(fā)生發(fā)展病理生理機(jī)制,作為起搏電流的特異性阻滯劑—伊伐布雷定,目前被證實(shí)通過抑制起搏電流進(jìn)而減少某些心律失常的發(fā)生,本研究擬探討伊伐布雷定在心房顫動(dòng)的預(yù)防和治療方面的作用以及對(duì)起搏電流及HCN通道的影響,為房顫的發(fā)病機(jī)制和防治打下理論基礎(chǔ)。方法本研究將5-6月齡大小、尚未發(fā)生房顫的轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為用藥組(15只)和對(duì)照組(15只),同齡的野生型C57B1/6小鼠也隨機(jī)分為用藥組(15只)和對(duì)照組(15只)；將伊伐布雷定(7mg/kg/天,加入飲用水)喂養(yǎng)用藥組小鼠,持續(xù)時(shí)間為4個(gè)月,平均每2周行心電監(jiān)測(cè),觀察心率變化情況及房顫的發(fā)生情況。本研究采用改良的Langendorff灌流裝置、二步消化法來急性分離小鼠心房肌細(xì)胞；采用VisualSonics Vevo770高分辨率小動(dòng)物超聲系統(tǒng)對(duì)小鼠行心臟超聲檢測(cè)；采用PCLAB-UE生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄小鼠的心電圖數(shù)據(jù)；采用標(biāo)準(zhǔn)的全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄動(dòng)作電位和離子通道電流；本研究采用RT-PCR方法檢測(cè)小鼠心房肌組織HCN通道改變情況；采用Western-Blot方法檢測(cè)小鼠心房肌組織HCN通道蛋白改變情況。結(jié)果經(jīng)過4個(gè)月的伊伐布雷定治療后,轉(zhuǎn)基因用藥組小鼠陣發(fā)性房顫的發(fā)生率對(duì)照組小鼠明顯降低(用藥組：41%比對(duì)照組：16.7%,p0.01),野生型小鼠未記錄到房顫發(fā)作。在體表心電數(shù)據(jù)方面,轉(zhuǎn)基因用藥組小鼠心率較對(duì)照組下降了約13%(用藥組：392±61；對(duì)照組：342±57次／分,p=0.042),對(duì)應(yīng)的QT間期和心率校正后的QT間期(QTc)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；野生型用藥組小鼠較對(duì)照組下降了約11%(用藥組436±51次/分比對(duì)照組：387±32次/分,p=0.044),其對(duì)應(yīng)的QT間期有所延長(zhǎng),但QTc無明顯差異。在心臟超聲數(shù)據(jù)方面,轉(zhuǎn)基因用藥組小鼠左室收縮末期內(nèi)徑較對(duì)照組小鼠有所縮短,射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)均有增加；野生型小鼠用藥組和對(duì)照組數(shù)據(jù)未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。膜片鉗單細(xì)胞動(dòng)作電位記錄方面,轉(zhuǎn)基因用藥組小鼠和對(duì)照組小鼠心房肌細(xì)胞靜息電位、APD20、APD50及APD90差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同樣,野生型用藥組小鼠和對(duì)照組小鼠心房肌細(xì)胞上述指標(biāo)亦均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在起搏電流記錄方面,轉(zhuǎn)基因用藥組小鼠心房肌起搏電流引出率較對(duì)照組明顯減低(46.7%比75.4%,p0.01),野生型用藥組小鼠和對(duì)照組未見差異(43.3%比49.2%,p=0.78)；轉(zhuǎn)基因小鼠用藥組和對(duì)照組起搏電流比較,用藥組小鼠的電流幅度較對(duì)照組小鼠的電流幅度明顯減弱,尾電流也明顯減小,用藥組小鼠的I±V曲線明顯上移,從-80mV～-170mV二者電流密度均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(在-170mV的電流密度,用藥組：-17.7±3.0pA/pF,對(duì)照組：-39.6±4.6pA/pF,p0.001),用藥組小鼠的穩(wěn)態(tài)激活曲線明顯左移,二者的半激活電壓(V1/2)(用藥組：-124.4±3.25mV,對(duì)照組：-109.45±0.72mV,p0.001)和斜率因子k(22.58±2.75mV比14.40±0.78mV,p0.001)均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。分子生物學(xué)方面,伊伐布雷定應(yīng)用后使得轉(zhuǎn)基因用藥組小鼠心房肌HCN2 mRNA相對(duì)表達(dá)下降了50%(用藥組：0.55±0.34比對(duì)照組：1.10±0.40,p=0.029),同樣HCN4mRNA相對(duì)表達(dá)量下降了約63.5%(0.54±0.41比1.48±0.63,p=0.012)；在野生型小鼠中用藥組和對(duì)照組心房肌組織的HCN2和HCN4 mRNA相對(duì)表達(dá)量均未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在應(yīng)用伊伐布雷定口服治療4個(gè)月后,轉(zhuǎn)基因用藥組小鼠和野生型用藥組小鼠心房肌組織HCN2(0.02±0.0078比0.0097±0.006)及HCN4蛋白相對(duì)表達(dá)量(0.18±±±0.10比0.22±0.15)差異亦未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 長(zhǎng)期伊伐布雷定治療能顯著降低尚未進(jìn)展為房顫的轉(zhuǎn)基因房小鼠的房顫發(fā)生率,對(duì)房顫的發(fā)生有一定的預(yù)防作用；伊伐布雷定治療能逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因房顫小鼠的心臟電生理改變,這主要是降低了起搏電流的“功能獲得”作用,進(jìn)而減弱了其自發(fā)性電活動(dòng)而起到抗心律失常作用；伊伐布雷定的抗心律失常作用不依賴于其降低心率的作用,主要可能是由于其抵消了轉(zhuǎn)基因小鼠的HCN通道超表達(dá),逆轉(zhuǎn)了轉(zhuǎn)基因小鼠心房肌的結(jié)構(gòu)改變；此外,長(zhǎng)期的伊伐布雷定治療并不影響小鼠的QTc間期,提示伊伐布雷定具有良好的安全性；長(zhǎng)期的伊伐布雷定治療后,用藥組小鼠的射血分?jǐn)?shù)及縮短分?jǐn)?shù)較對(duì)照組顯著增大,提示伊伐布雷定對(duì)于心肌收縮力的增強(qiáng)也有一定的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R541.75
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本文編號(hào)：2385133