【摘要】：micro RNAs(mi RNAs)是一類非編碼小分子RNA,通過與信使RNA(messager RNA,m RNA)3'端非編碼區(qū)(3'untranslated region,3'UTR)序列結合,抑制靶m RNA翻譯或促進m RNA降解。mi RNAs作為精細調(diào)控因子,在機體復雜的病理生理過程中發(fā)揮著重要作用。研究證實,mi RNAs(mi R-1、mi R-133和mi R-499)被證實參與調(diào)控心臟發(fā)育和心血管系統(tǒng)的正常生理調(diào)控過程。mi RNAs在時間和空間上表達譜的改變均可提示不同的病理過程(如急性心肌梗死、心衰)。近年來,血漿mi RNAs分子因其穩(wěn)定性和易檢測性在心血管研究領域中已越來越受到人們的廣泛關注,為揭示其分子生物學功能提供新的線索,并有望成為疾病診斷和分子治療的靶標。mi R-28作為內(nèi)含子型mi RNA,定位于3號染色體LIM區(qū)域LPP(Lipoma Preferred Partner)基因。盡管mi R-28的生物學功能研究尚不充分,但已有研究表明mi R-28可參與調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡,并異常表達于骨髓增生異常綜合征患者的血小板中以及宮頸癌、結直腸癌患者的外周血中。最新研究證實,內(nèi)含子型mi R-28可直接靶向抑制LPP基因的表達,而LPP的生物學功能主要是促進細胞的遷移和粘附,并在人類腫瘤中處于高表達狀態(tài)。值得關注的是LPP被證實可促進受損血管平滑肌細胞的遷移和增殖,促進粥樣斑塊的形成和發(fā)展,因此基于內(nèi)含子mi R-28與宿主基因LPP的作用方式,我們推測mi R-28可能參與了動脈粥樣硬化的病理過程,但具體作用機制除了可靶向抑制LPP基因的表達對其他靶基因和作用機制還尚不明確。本研究擬在體外細胞學實驗中選取和動脈粥樣硬化發(fā)生機制較為緊密的Hep G2和THP-1分化的巨噬細胞,采用瞬時轉(zhuǎn)染的方法將mi R-28-5p模擬物或抑制物轉(zhuǎn)入細胞中獲得高或低表達的細胞模型。結合生物信息學軟件對mi R-28-5p的靶基因進行預測,采用分子生物學技術對Nrf2/Mad2/ERk2進行驗證,并擬選定ERK2作為進一步探討mi R-28-5p生物學功能的主要基因。通過實時定量PCR和蛋白免疫印跡技術探求mi R-28-5p是否參與調(diào)控ERK2介導的ABCA1和LXR介導的ABCA1/ABCG1信號通路,從而進一步闡明mi R-28-5p在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中的分子生物學作用。根據(jù)前期體外細胞學實驗基礎及基因芯片分析發(fā)現(xiàn)在不穩(wěn)定型心絞痛患者血漿mi R-28-5p可作為候選基因區(qū)分于表觀健康成年人,并采用探針實時定量PCR技術檢測mi R-28-5p在不穩(wěn)定型心絞痛與性別年齡匹配的表觀健康成年人血漿中的表達情況,分析其是否具有統(tǒng)計學差異表達或與臨床指標是否具有相關性。第一部分mi R-28-5p生物信息學靶基因在Hep G2細胞中的驗證目的:在Hep G2細胞中,篩選并驗證Nrf2/Mad2/ERK2是否為mi R-28-5p的靶基因,為深入研究mi R-28-5p的生物學功能提供分子基礎。方法:應用生物信息學軟件對mi R-28-5p的靶基因進行預測和篩選,同時采用Western Blot方法對靶基因進行驗證。結果：1 mi RNA-28-5p靶基因的生物信息學預測目前對mi RNAs生物信息靶基因的預測主要是通過應用生物信息學軟件進行預測,綜合對Target Scan、Pic Tar、Mir Base等多個生物信息學軟件預測的結果分析顯示:mi RNA-28-5p屬于3號染色體,位于3q27-28。本實驗選取了預測p值較低的ERK2/Mad2作為下一步候選基因進行驗證,同時根據(jù)文獻報道選用已被證實為mi R-28-5p的靶基因Nrf2作為對照,證實轉(zhuǎn)染實驗的可行性(Table 1,2)。2采用Western Blot方法驗證Nrf2是mi R-28-5p的靶基因我們應用Western Blot方法對Nrf2在Hep G2是否為mi R-28-5p的靶基因進行驗證。本實驗將mi R-28-5p模擬物和mi R-28-5p抑制物(mi R-28-5p mimic和inhibitor)分別轉(zhuǎn)染至Hep G2細胞中,通過收集細胞蛋白質(zhì)觀察Nrf2表達情況。在Hep G2細胞中,轉(zhuǎn)染mi R-28-5p mimic組其Nrf2表達量較未轉(zhuǎn)染組顯著下調(diào),轉(zhuǎn)染mi R-28-5p inhibitor后Nrf2表達量較未轉(zhuǎn)染組顯著上升,證實在Hep G2細胞中Nrf2是mi R-28-5p的靶基因(Figure 1)。3采用Western Blot方法驗證Mad2/ERK2是mi R-28-5p的靶基因應用經(jīng)典的Western Blot方法對Mad2/ERK2在Hep G2細胞中是否為mi R-28-5p的靶基因進行驗證。本實驗將mi R-28-5p mimic/inhibitor成功轉(zhuǎn)染至Hep G2細胞系中,通過收集細胞蛋白質(zhì)觀察Mad2/ERK2表達情況。在Hep G2細胞中,轉(zhuǎn)染mi R-28-5p mimic組其Mad2/ERK2表達量較未轉(zhuǎn)染組顯著下調(diào),轉(zhuǎn)染mi R-28-5p inhibitor后Mad2/ERK2的蛋白表達水平顯著上調(diào),表達差異具有統(tǒng)計學意義,證實Mad2/ERK2在Hep G2細胞中是mi R-28-5p的靶基因(Figure 2,3)。小結：從分子生物學角度驗證了在Hep G2細胞中mi R-28-5p可直接靶向抑制Nrf2/Mad2/ERK2基因的表達。第二部分mi RNA-28-5p通過靶向抑制ERK2上調(diào)ABCA1表達目的:探討mi R-28-5p是否可通過ERK2影響ABCA1的表達,參與動脈粥樣硬化的病理過程。方法:利用瞬時轉(zhuǎn)染的方法將mi R-28-5p mimic和mi R-28-5p inhibitor轉(zhuǎn)染至Hep G2細胞中,通過Western Blot方法檢測ABCA1蛋白水平的表達情況,并應用ERK2抑制劑觀察對ABCA1表達的影響,探討mi R-28-5p是否通過靶向抑制ERK2影響ABCA1的表達水平。結果：1在Hep G2細胞中,mi R-28-5p mimic上調(diào)ABCA1的表達ERK2作為ABCA1的負向調(diào)控因子,我們嘗試性的探索mi R-28-5p是否可影響ABCA1的表達。Western blot結果顯示,過表達mi R-28-5p可顯著性上調(diào)ABCA1蛋白的表達,而加入mi R-28-5p抑制物后可顯著性下調(diào)ABCA1蛋白水平(P0.05;Figure 1A and B),證實mi R-28-5p在蛋白水平上調(diào)ABCA1的表達。2 ERK2抑制劑上調(diào)ABCA1蛋白的表達為了進一步確認ERK2在Hep G2細胞中是否對ABCA1蛋白的表達產(chǎn)生影響,我們將ERK2抑制劑(PD98059)與Hep G2細胞過夜孵育。根據(jù)已有文獻報道,ERK2抑制劑在巨噬細胞誘導ABCA1產(chǎn)生最大效應的劑量為20μM。Western blot結果顯示在Hep G2細胞中,ERK2抑制劑在劑量為20μM可顯著性上調(diào)ABCA1蛋白表達水平,且20μM和40μM對ABCA1的表達無顯著性差異(Figure 2)。3 mi R-28-5p通過靶向抑制ERK2上調(diào)ABCA1的表達。為了明確mi R-28-5p是否通過ERK2影響ABCA1的表達,我們首先將mi R-28-5p inhibitor轉(zhuǎn)染到Hep G2細胞中以對抗細胞內(nèi)源性mi R-28-5p,轉(zhuǎn)染30h小時后加入ERK2抑制劑過夜孵育。Western blot結果顯示ERK2抑制劑可恢復因mi R-28-5p inhiitor導致的ABCA1表達下調(diào)(Figure3)。證實mi R-28-5p作為內(nèi)含子型mi RNA,可通過靶向抑制ERK2基因上調(diào)ABCA1的表達。小結：1在Hep G2細胞中,過表達mi RNA-28-5p可顯著上調(diào)ABCA1蛋白的表達,抑制胞內(nèi)mi R-28-5p的表達可顯著下調(diào)ABCA1的表達。2在Hep G2細胞中,應用ERK2抑制劑可顯著上調(diào)ABCA1蛋白的表達。3在Hep G2細胞中,mi R-28-5p通過靶向抑制ERK2,上調(diào)ABCA1的基因表達。第三部分mi RNA-28-5p對LXRα-ABCA1/ABCG1通路的影響目的:在THP-1分化的巨噬細胞和Hep G2細胞中探討過表達mi R-28-5p對LXRα介導的ABCA1/ABCG1信號通路的影響。方法:利用瞬時轉(zhuǎn)染的方法將mi R-28-5p mimic轉(zhuǎn)染至THP-1分化的巨噬細胞和Hep G2細胞中,通過Real-time PCR和Western Blot方法檢測ABCA1、ABCG1、LXRα轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達情況,并探討mi R-28-5p在介導LXRα-ABCA1/ABCG1通路中的作用。結果：1 mi R-28-5p在THP-1分化的巨噬細胞上調(diào)ABCA1的表達我們嘗試性的在THP-1分化的巨噬細胞中探索mi R-28-5p對ABCA1表達水平的影響,同時將Hep G2細胞作為對照。本實驗中主要應用實時定量PCR和Western Blot方法,結果(Figure 1,2)所示,過表達mi R-28-5p上調(diào)ABCA1的基因表達。2 mi R-28-5p在THP-1分化的巨噬細胞和Hep G2細胞中對ABCG1的表達影響ABCA1和ABCG1在調(diào)節(jié)膽固醇反向轉(zhuǎn)運過程中具有相互協(xié)調(diào)的作用,ABCG1促進膽固醇從富含脂質(zhì)的巨噬細胞中流出至HDL顆粒。我們已證實過表達mi R-28-5p可上調(diào)ABCA1的表達,為了進一步檢測mi R-28-5p對ABCG1的影響,我們利用實時定量PCR和Western Blot方法檢測轉(zhuǎn)染mi R-28-5p后ABCG1的表達水平,結果(Figure 3)統(tǒng)計顯示:轉(zhuǎn)染mi R-28-5p mimic后上調(diào)ABCG1的蛋白表達水平(P0.05),但轉(zhuǎn)錄水平無變化(Figure4)。3 mi R-28-5p上調(diào)ABCA1/ABCG1關鍵調(diào)節(jié)因子LXRalpha的蛋白表達LXR的主要生物學功能是調(diào)控ABCA1/ABCG1的表達。在HDL的生物合成和轉(zhuǎn)運過程中,LXRalpha的活化或上調(diào)均可直接提高ABCA1/ABCG1的表達水平進而促進膽固醇的反向轉(zhuǎn)運,影響動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展�；趍i R-28-5p對ABCA1/ABCG1的上調(diào)作用,本部分進一步觀察mi R-28-5p對LXR的基因表達的調(diào)節(jié)作用。我們利用實時定量PCR和Western Blot方法檢測LXRalpha和LXRbeta的m RNA和蛋白水平。結果顯示(Figure 5):LXRalpha的蛋白表達水平在THP-1分化的巨噬細胞和Hep G2細胞中mi R-28-5p轉(zhuǎn)染組中表達明顯升高(p0.05),但在m RNA水平上無明顯意義(Figure 6)。小結：1在THP-1分化的巨噬細胞中,mi RNA-28-5p mimic轉(zhuǎn)染后上調(diào)ABCA1的基因表達。2在THP-1分化的巨噬細胞和Hep G2細胞中,mi RNA-28-5p mimic轉(zhuǎn)染后上調(diào)ABCG1蛋白水平,對m RNA水平?jīng)]有顯著性影響。3 mi RNA-28-5p mimic轉(zhuǎn)染后,巨噬細胞中LXRa的基因表達在翻譯水平被上調(diào)。第四部分mi RNA-28-5p在不穩(wěn)定型心絞痛患者中的表達及意義目的:分析mi R-28-5p在不穩(wěn)定型心絞痛患者血漿中的表達水平,與性別、年齡匹配的表觀健康成年人作為對照,并探討mi R-28-5p表達水平與疾病診斷的可行性和相關臨床資料的相關性。方法:從380例冠心病患者中篩選出39例不穩(wěn)定型心絞痛患者,同期從我院健康體檢中心中選取年齡、性別匹配的健康體檢者28名作為對照并應用定量Real-time PCR檢測mi RNA-28-5p在不穩(wěn)定型心絞痛患者及與性別、年齡相匹配的表觀健康成年人中的差異表達情況,應用Graph PAD Prism5.0獨立樣本t檢驗的統(tǒng)計學方法研究其表達水平在不穩(wěn)定型心絞痛患者中的意義,并探討是否與脂代謝臨床指標具有相關性。結果:1臨床資料的數(shù)據(jù)分析1.1不穩(wěn)定型心絞痛患者39例,其中21例為男性,18例為女性;年齡范圍為35至70歲,平均年齡58±9歲。所有患者根據(jù)ACC/AHA 2007年不穩(wěn)定型心絞痛/非ST段抬高型心肌梗死診斷指南。表觀健康體檢人群28例,其中男性13例,女性15例,平均年齡55±8歲。1.2不穩(wěn)定型心絞痛和表觀健康對照組間臨床指標無明顯統(tǒng)計學差異如空腹血糖(Glu)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)和吸煙史(P0.05);組間總膽固醇(CHOL)高密度脂蛋白(HDL-C)存在顯著性差異(P0.05,Table 1)。2血漿mi R-28-5p的差異表達分析2.1我們前期芯片研究顯示血漿中mi R-28-5p和mi R-28-3p可作為不穩(wěn)定型心絞痛患者區(qū)分表觀健康成年人的候選基因。芯片分析顯示mi R-28-5p表達水平要高于mi R-28-3p,但二者的血漿水平遠低于內(nèi)參mi RNA-423-5p。因此我們選擇表達峰值稍高的mi R-28-5p做進一步驗證實驗(Table 2)。應用Taq Man探針法檢測在不穩(wěn)定型心絞痛和表觀健康對照組人群中外周血血漿mi R-28-5p的表達水平。2.2不穩(wěn)定型心絞痛患者組血漿mi R-28-5p的表達水平2-?Ct為(0.026,(0.0077,0.0460)),表觀健康對照組血漿中mi R-28-5p的表達水平2-?Ct為(0.0058,(0.0038,0.0118))。不穩(wěn)定型心絞痛患者血漿中mi R-28-5p的表達水平顯著性升高,差異具有統(tǒng)計學意義(Figure 1A)。3應用ROC曲線分析血漿mi R-28-5p表達對不穩(wěn)定型心絞痛的診斷價值為了進一步評估m(xù)i R-28-5p作為潛在冠心病分子靶標的可行性,我們進行了ROC曲線分析。其曲線下面積(AUC)介于0.5至0.7時對疾病的診斷具有較低的準確性,AUC在0.7-0.9間具有一定的準確性,AUC大于0.9時則具有較高的準確性。分析顯示血漿中mi R-28-5p表達水平對于不穩(wěn)定型心絞痛患者具有一定的診斷價值,AUC為0.714(Figure 1B;95%可信區(qū)間(CI):0.5860-0.8426)。4相關性分析為了進一步研究影響不穩(wěn)定型心絞痛患者mi R-28-5p表達水平的因素,我們對臨床數(shù)據(jù)進行相關性分析,血漿mi R-28-5p表達水平與HDL檢驗值呈正相關(R=0.327;p=0.042;Figure 2)。小結：在不穩(wěn)定型心絞痛患者中,血漿mi RNA-28-5p水平被顯著性上調(diào),且與血清HDL-C水平正相關,提示血漿mi R-28-5p可作為冠心病早期防治、預后評價的潛在的分子標志物,為深入研究mi R-28-5p在體內(nèi)膽固醇代謝和不穩(wěn)定型心絞痛間的內(nèi)在聯(lián)系提供了新的線索。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R543.5
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9 本報記者 王t，
本文編號：2376767
