【摘要】：目的:慢性腎臟病(Chronic Kidney disease,CKD)患者死亡的首要病因是心血管疾病(Cardiovascular Disease,CVD),血管鈣化是導(dǎo)致CKD患者CVD發(fā)病率和死亡率增加的關(guān)鍵環(huán)節(jié),CKD患者的血管鈣化主要發(fā)生在血管中膜。血管中膜的主要成分是血管平滑肌細(xì)胞(Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs),研究發(fā)現(xiàn),維生素K2可以抑制血管中膜鈣化,但其具體機(jī)制尚不明確。為了探討維生素K2對(duì)血管中膜鈣化的影響及作用機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)以高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化為模型,觀察了維生素K2對(duì)其核心結(jié)合因子α1(Core factor of alpha 1,Cbfα1)m RNA及蛋白和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Bone morphogenetic protein 2,BMP-2)、SMAD1、SMAD7、Axl(Anexelekto)、B-細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)基因m RNA的表達(dá)變化以及細(xì)胞凋亡的影響。方法:1運(yùn)用胸主動(dòng)脈組織塊貼壁法原代培養(yǎng)獲取VSMCs,進(jìn)行形態(tài)學(xué)及免疫細(xì)胞鑒定。2實(shí)驗(yàn)分組:將VSMCs隨機(jī)分為正常對(duì)照組、高磷組干預(yù)組、維生素K2干預(yù)組(10μmol/L)、維生素K2干預(yù)組(25μmol/L)及維生素K2干預(yù)組(50μmol/L),陰性對(duì)照組采用低糖DMEM含10%胎牛血清的正常培養(yǎng)基培養(yǎng),高磷組在正常培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入10 mmol/L的β-甘油磷酸制成高磷培養(yǎng)基培養(yǎng),維生素K2干預(yù)組在上述高磷培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入維生素K2,使維生素K2的終濃度分別為10μmol/L、25μmol/L和50μmol/L。3鈣化檢測(cè):VSMCs的鈣化通過茜素紅染色來檢測(cè),并用比色法檢測(cè)其鈣含量。4運(yùn)用RT-PCR方法觀察了不同濃度維生素K2對(duì)VSMCs中核心結(jié)合因子α1(Core factor of alpha 1,Cbfα1)m RNA及蛋白,骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Bone morphogenetic protein 2,BMP-2)、SMAD1、SMAD7、Axl(Anexelekto)、B-細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-celllymphoma/leukemia-2,Bcl-2)基因m RNA表達(dá)水平的影響。5運(yùn)用Western-blot方法觀察了不同濃度維生素K2對(duì)VSMCs中Cbfα1蛋白表達(dá)水平的影響。6運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率:先以0.25%胰酶消化收集的各組細(xì)胞,再用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次,將細(xì)胞重懸于70%乙醇中固定24h后,加入適量PI染液混勻,室溫15 min后上機(jī)。7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:實(shí)驗(yàn)所取得的數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示,采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析(ANOVA),兩兩比較用SNK(Student-Newman-Keuls)檢驗(yàn),結(jié)果以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1 VSMCs原代培養(yǎng):大鼠VSMCs的獲取采用胸主動(dòng)脈組織塊貼壁培養(yǎng)法,一般情況下大約3-4d后即可見少許細(xì)胞爬出,形態(tài)為長(zhǎng)梭形,排列較分散,約6-7d后細(xì)胞數(shù)目逐漸增多,鋪滿大部分瓶底。當(dāng)80%-90%的瓶底面積鋪滿細(xì)胞后,便可進(jìn)行傳代培養(yǎng),傳代后的細(xì)胞最初近似為圓形,貼壁后其逐漸變?yōu)樗笮位蛐切?有突起,細(xì)胞胞漿豐富,核大呈橢圓形,典型的呈現(xiàn)為“峰—谷”樣交互重疊生長(zhǎng)。通過免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體(α-SMA actin),其為平滑肌細(xì)胞特異性的抗體,出現(xiàn)棕黃色的免疫反應(yīng)產(chǎn)物在細(xì)胞胞漿強(qiáng)表達(dá),即為陽性結(jié)果。幾乎所有細(xì)胞均在細(xì)胞胞漿強(qiáng)表達(dá)。2維生素K2對(duì)高磷誘導(dǎo)的大鼠VSMCs鈣化的影響:培養(yǎng)至第14天時(shí)茜素紅染色結(jié)果顯示,高磷組的橘紅色礦化結(jié)節(jié)明顯多于正常對(duì)照組;與高磷組相比,維生素K2干預(yù)組的橘紅色礦化結(jié)節(jié)減少,且隨維生素K2濃度的增高,橘紅色礦化結(jié)節(jié)越來越少。鈣含量測(cè)定結(jié)果與茜素紅染色結(jié)果基本一致。3維生素K2對(duì)高磷誘導(dǎo)的大鼠VSMCs的BMP通路的影響:RT-PCR法觀察結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,高磷組的BMP-2和SMAD1m RNA表達(dá)明顯增高(P0.05),而維生素K2干預(yù)組的BMP-2和SMAD1m RNA表達(dá)隨濃度增高而逐漸降低(P0.05)。高磷組的SMAD7m RNA表達(dá)明顯降低(P0.05),而維生素K2干預(yù)組的SMAD7m RNA表達(dá)隨濃度增高而逐漸升高(P0.05)。4維生素K2對(duì)高磷誘導(dǎo)的大鼠VSMCs凋亡的影響:PI染色結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,高磷干預(yù)組細(xì)胞凋亡率顯著增加(P0.05);與高磷干預(yù)組相比,維生素K2各劑量干預(yù)組細(xì)胞凋亡率均顯著降低(P0.05)。RT-PCR法研究結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,高磷組Axl m RNA表達(dá)明顯減弱(P0.05),維生素K2干預(yù)組的Axl m RNA表達(dá)增加,且隨維生素K2濃度的增高,Axl m RNA表達(dá)逐漸增高,以50μmol/L維生素K2組達(dá)最高(見圖3)。而Bcl-2的表達(dá)各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1本課題采用胸主動(dòng)脈組織塊貼壁法成功地培養(yǎng)了大鼠VSMCs,為VSMCs原代培養(yǎng)搭建了一個(gè)平臺(tái)。2維生素K2可以抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs的血管鈣化。3維生素K2抑制VSMCs的血管鈣化的機(jī)制,一方面與維生素K2抑制BMP信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)而抑制了血管平滑肌細(xì)胞成骨成軟骨樣表型轉(zhuǎn)化有關(guān);另一方面與維生素K2的抗凋亡作用有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R543

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