【摘要】：目的探討Wnt-11體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)分化為心肌樣細(xì)胞的最適濃度。方法采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)SD大鼠BMMSCs,取第2代BMMSCs培養(yǎng)48h后進(jìn)行定向誘導(dǎo),根據(jù)Wnt-11終濃度的不同分為A組(100ng/mL),B組(200ng/mL),C組(400ng/mL)和D組(空白對(duì)照組),誘導(dǎo)72h后更換為完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4周,D組僅用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀(guān)察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)對(duì)BMMSCs表面聯(lián)合標(biāo)記物進(jìn)行鑒定。各組細(xì)胞培養(yǎng)至第4周時(shí),運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)結(jié)蛋白(Desmin)、間隙連接蛋白43(Connexin43)及心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的表達(dá)情況。運(yùn)用透射電鏡觀(guān)察分化細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測(cè)各組細(xì)胞在誘導(dǎo)后培養(yǎng)第1、2、4周時(shí)心肌早期轉(zhuǎn)錄因子GATA-4、Nkx2.5及α-MHC的表達(dá)。結(jié)果 1原代BMMSCs于第2周形成集落,多呈梭形、星形,少數(shù)形狀不規(guī)則。傳代后細(xì)胞體積變大,誘導(dǎo)后細(xì)胞多為長(zhǎng)梭形,呈一致性生長(zhǎng)。2流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)對(duì)BMMSCs表面聯(lián)合標(biāo)記物的鑒定結(jié)果顯示CD29、CD45、CD90的陽(yáng)性表達(dá)率分別為97.9%、0.4%和99.5%。3免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示:誘導(dǎo)后常規(guī)培養(yǎng)至第4周,A組、B組、C組細(xì)胞胞質(zhì)均呈陽(yáng)性表達(dá)Desmin、Connexin43和cTnI,而D組細(xì)胞呈弱陽(yáng)性或陰性表達(dá),B組細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)率均最高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4透射電鏡結(jié)果顯示:各誘導(dǎo)組細(xì)胞于誘導(dǎo)后常規(guī)培養(yǎng)至第4周,胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)平行排列的肌絲及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)如線(xiàn)粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體。5RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示:BMMSCs經(jīng)誘導(dǎo)后,常規(guī)培養(yǎng)第1周時(shí)各誘導(dǎo)組細(xì)胞均表達(dá)GATA-4及Nkx2.5基因,在第2周時(shí)表達(dá)減弱,在第4周時(shí)表達(dá)增強(qiáng),就基因表達(dá)而言,三個(gè)誘導(dǎo)組相比較,B組明顯優(yōu)于其他兩組(P0.05)。α-MHC基因在誘導(dǎo)后常規(guī)培養(yǎng)期間均不表達(dá)。對(duì)照組細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)期間GATA-4及Nkx2.5基因的表達(dá)量為1,而不表達(dá)α-MHC基因。結(jié)論 Wnt-11可在體外誘導(dǎo)SD大鼠BMMSCs定向分化為心肌樣細(xì)胞,其誘導(dǎo)分化最適濃度為200ng/mL。
[Abstract]:Objective to investigate the optimal concentration of Wnt-11 in inducing (BMMSCs) differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into cardiomyoid cells. Methods BMMSCs, of SD rats were isolated and cultured by whole bone marrow adherent method for 48h and then cultured for 48h. According to the final concentration of Wnt-11, they were divided into group A (100ng/mL), B group) and group A (200ng/mL). Group C (400ng/mL) and group D (blank control group) were treated with complete culture medium for 4 weeks after 72 h induction. The morphological changes of cultured cells were observed under inverted phase contrast microscope. BMMSCs surface markers were identified by flow cytometry. The expression of desmin (Desmin), gap junction protein 43 (Connexin43) and cardiac troponin I (cTnI) were detected by immunocytochemical staining at the 4th week. The ultrastructural changes of differentiated cells were observed by transmission electron microscope (TEM). Real-time quantitative polynucleotide chain reaction (real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR) was used to detect the expression of early transcription factors (GATA-4,Nkx2.5 and 偽-MHC) in myocardium of each group at 4 weeks after induction. Results 1 the primary BMMSCs formed colony at the 2nd week, mostly fusiform, starlike, and a few irregular shape. After passage, the cells became larger, and most of the cells were spindle shape after induction. 2 the results of identification of BMMSCs surface markers by flow cytometry showed that the positive expression rates of CD29,CD45,CD90 were 97.9%, respectively. The results of immunocytochemical staining of 0.4% and 99.5.3% showed that the cytoplasm of the cells in groups A, B and C were positive for Desmin,Connexin43 and cTnI, in the 4th week after induction. Group D showed weak positive or negative expression, and group B had the highest positive rate (P0.05). 4 the results of transmission electron microscope showed that the cells of each induction group were cultured to 4 weeks after induction. In the cytoplasm, parallel arrangement of myofilaments and subcellular structures such as mitochondria, rough endoplasmic reticulum and ribosome were observed. The results of 5RT-qPCR detection showed that GATA-4 and Nkx2.5 genes were expressed in the cells of each group at the first week of conventional culture after induction of BMMSCs. At the second week, the expression of 偽-MHC was decreased and increased at the 4th week. Compared with the other two groups, group B was significantly better than the other two groups in gene expression (P0.05). 偽-MHC gene was not expressed in the normal culture period after induction. In the control group, the expression of GATA-4 and Nkx2.5 genes was 1 during conventional culture, but 偽-MHC gene was not expressed. Conclusion Wnt-11 can induce SD rat BMMSCs to differentiate into cardiomyocyte-like cells in vitro, and the optimal concentration is 200ng / mL.
【作者單位】： 河北北方學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室;河北北方學(xué)院人體解剖學(xué)教研室;
【基金】：河北省自然科學(xué)基金(No.H2015405017);河北省自然科學(xué)基金(No.H2014405005) 河北北方學(xué)院創(chuàng)新培育項(xiàng)目(No.CXRC1315) 河北省教育廳重大項(xiàng)目(No.ZH2012001)~~
【分類(lèi)號(hào)】：R54

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本文編號(hào)：2364205