【摘要】：目的探討Wnt-11體外誘導骨髓間充質(zhì)干細胞(BMMSCs)分化為心肌樣細胞的最適濃度。方法采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)SD大鼠BMMSCs,取第2代BMMSCs培養(yǎng)48h后進行定向誘導,根據(jù)Wnt-11終濃度的不同分為A組(100ng/mL),B組(200ng/mL),C組(400ng/mL)和D組(空白對照組),誘導72h后更換為完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4周,D組僅用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)學變化。運用流式細胞儀檢測技術對BMMSCs表面聯(lián)合標記物進行鑒定。各組細胞培養(yǎng)至第4周時,運用免疫細胞化學染色技術檢測結(jié)蛋白(Desmin)、間隙連接蛋白43(Connexin43)及心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的表達情況。運用透射電鏡觀察分化細胞的超微結(jié)構(gòu)變化。實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測各組細胞在誘導后培養(yǎng)第1、2、4周時心肌早期轉(zhuǎn)錄因子GATA-4、Nkx2.5及α-MHC的表達。結(jié)果 1原代BMMSCs于第2周形成集落,多呈梭形、星形,少數(shù)形狀不規(guī)則。傳代后細胞體積變大,誘導后細胞多為長梭形,呈一致性生長。2流式細胞儀檢測技術對BMMSCs表面聯(lián)合標記物的鑒定結(jié)果顯示CD29、CD45、CD90的陽性表達率分別為97.9%、0.4%和99.5%。3免疫細胞化學染色技術檢測結(jié)果顯示:誘導后常規(guī)培養(yǎng)至第4周,A組、B組、C組細胞胞質(zhì)均呈陽性表達Desmin、Connexin43和cTnI,而D組細胞呈弱陽性或陰性表達,B組細胞的陽性表達率均最高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4透射電鏡結(jié)果顯示:各誘導組細胞于誘導后常規(guī)培養(yǎng)至第4周,胞質(zhì)內(nèi)可見平行排列的肌絲及亞細胞結(jié)構(gòu)如線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體。5RT-qPCR檢測結(jié)果顯示:BMMSCs經(jīng)誘導后,常規(guī)培養(yǎng)第1周時各誘導組細胞均表達GATA-4及Nkx2.5基因,在第2周時表達減弱,在第4周時表達增強,就基因表達而言,三個誘導組相比較,B組明顯優(yōu)于其他兩組(P0.05)。α-MHC基因在誘導后常規(guī)培養(yǎng)期間均不表達。對照組細胞在常規(guī)培養(yǎng)期間GATA-4及Nkx2.5基因的表達量為1,而不表達α-MHC基因。結(jié)論 Wnt-11可在體外誘導SD大鼠BMMSCs定向分化為心肌樣細胞,其誘導分化最適濃度為200ng/mL。
[Abstract]:Objective to investigate the optimal concentration of Wnt-11 in inducing (BMMSCs) differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into cardiomyoid cells. Methods BMMSCs, of SD rats were isolated and cultured by whole bone marrow adherent method for 48h and then cultured for 48h. According to the final concentration of Wnt-11, they were divided into group A (100ng/mL), B group) and group A (200ng/mL). Group C (400ng/mL) and group D (blank control group) were treated with complete culture medium for 4 weeks after 72 h induction. The morphological changes of cultured cells were observed under inverted phase contrast microscope. BMMSCs surface markers were identified by flow cytometry. The expression of desmin (Desmin), gap junction protein 43 (Connexin43) and cardiac troponin I (cTnI) were detected by immunocytochemical staining at the 4th week. The ultrastructural changes of differentiated cells were observed by transmission electron microscope (TEM). Real-time quantitative polynucleotide chain reaction (real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR) was used to detect the expression of early transcription factors (GATA-4,Nkx2.5 and 偽-MHC) in myocardium of each group at 4 weeks after induction. Results 1 the primary BMMSCs formed colony at the 2nd week, mostly fusiform, starlike, and a few irregular shape. After passage, the cells became larger, and most of the cells were spindle shape after induction. 2 the results of identification of BMMSCs surface markers by flow cytometry showed that the positive expression rates of CD29,CD45,CD90 were 97.9%, respectively. The results of immunocytochemical staining of 0.4% and 99.5.3% showed that the cytoplasm of the cells in groups A, B and C were positive for Desmin,Connexin43 and cTnI, in the 4th week after induction. Group D showed weak positive or negative expression, and group B had the highest positive rate (P0.05). 4 the results of transmission electron microscope showed that the cells of each induction group were cultured to 4 weeks after induction. In the cytoplasm, parallel arrangement of myofilaments and subcellular structures such as mitochondria, rough endoplasmic reticulum and ribosome were observed. The results of 5RT-qPCR detection showed that GATA-4 and Nkx2.5 genes were expressed in the cells of each group at the first week of conventional culture after induction of BMMSCs. At the second week, the expression of 偽-MHC was decreased and increased at the 4th week. Compared with the other two groups, group B was significantly better than the other two groups in gene expression (P0.05). 偽-MHC gene was not expressed in the normal culture period after induction. In the control group, the expression of GATA-4 and Nkx2.5 genes was 1 during conventional culture, but 偽-MHC gene was not expressed. Conclusion Wnt-11 can induce SD rat BMMSCs to differentiate into cardiomyocyte-like cells in vitro, and the optimal concentration is 200ng / mL.
【作者單位】： 河北北方學院組織學與胚胎學教研室;河北北方學院人體解剖學教研室;
【基金】：河北省自然科學基金(No.H2015405017);河北省自然科學基金(No.H2014405005) 河北北方學院創(chuàng)新培育項目(No.CXRC1315) 河北省教育廳重大項目(No.ZH2012001)~~
【分類號】：R54

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本文編號：2364205