發(fā)布時(shí)間：2018-11-22 10:38

【摘要】：研究背景和目的內(nèi)毒素血癥是由革蘭陰性菌細(xì)胞壁主要成分內(nèi)毒素引起的,可誘發(fā)內(nèi)毒素性休克,導(dǎo)致多器官損害及功能衰竭。心臟是內(nèi)毒素血癥時(shí)最常受累器官之一,心肌損傷是內(nèi)毒素血癥重要臨床表現(xiàn),是導(dǎo)致ICU患者死亡的主要原因,但是其確切機(jī)制目前并不十分清楚。microRNA(miRNA, miR)是一類廣泛存在于真核生物中,長約21-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA,具有促進(jìn)mRNA降解或抑制其轉(zhuǎn)錄發(fā)揮蛋白水平的調(diào)節(jié)功能,在心肌肥大、心肌梗死和心肌纖維化等心臟疾病中起著重要作用,因而被認(rèn)為是心臟功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者和預(yù)防、診斷、治療心臟疾病的潛在生物分子。研究miRNA在心臟疾病中作用機(jī)制,對于闡明心臟疾病發(fā)病的分子機(jī)制,指導(dǎo)開發(fā)miRNA靶標(biāo)治療相關(guān)心臟疾病的新藥物,為心臟疾病提供新的診斷和預(yù)后標(biāo)志物,提供新的思路與方法和開辟新的道路,具有重要的意義和應(yīng)用價(jià)值。本研究以內(nèi)毒素血癥致心肌損傷大鼠為研究對象,應(yīng)用多種分子生物技術(shù)和生物信息學(xué)的方法,從基因?qū)W水平分析心肌組織miRNA差異表達(dá)譜的變化,驗(yàn)證和預(yù)測miRNA可能調(diào)控的靶基因,旨在揭示miRNA在內(nèi)毒素血癥心肌損傷中可能的作用機(jī)制和發(fā)現(xiàn)對其防治具有干預(yù)作用的新的靶分子提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目前,大部分疾病的發(fā)病作用機(jī)制研究是在動(dòng)物模型上完成的,然而人類的遺傳特性與動(dòng)物之間存在很大的差異,使用動(dòng)物模型來研究人類疾病,難以完全揭示人類疾病真實(shí)本質(zhì)。因而,尋找新的有效的研究方法和技術(shù),發(fā)展和建立體外人類疾病研究模型,可為研究闡明其發(fā)生的病理生理學(xué)作用機(jī)制和研發(fā)治療藥物及其作用靶標(biāo)提供重要的研究工具,對開展疾病發(fā)病的基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)研究具有重要的應(yīng)用意義和價(jià)值。誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cells, IPSCs)是指一種利用特定的轉(zhuǎn)錄因子將體細(xì)胞重編程而獲得的類似于胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells、 ESC)的多分化潛能的干細(xì)胞。它具有ESC細(xì)胞相似的自我更新能力及分化為各種器官的潛在能力；且因?yàn)槠溥z傳物質(zhì)與患者的一致,不會(huì)出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng),沒有倫理學(xué)阻礙,又擁有細(xì)胞來源豐富等特點(diǎn)；這些優(yōu)勢使其已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞移植治療,器官再生,構(gòu)建疾病細(xì)胞模型,建立疾病特異性多功能干細(xì)胞以及疾病發(fā)生機(jī)制、新的治療方法、新藥篩選和藥物毒理等方面的研究。目前,研究報(bào)道多種疾病特異性誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞系已獲成功建立,但縱觀國內(nèi)外,尚未見到利用內(nèi)毒素血癥肺損傷患者體細(xì)胞成功誘導(dǎo)出多能干細(xì)胞的報(bào)道。我們在體外利用Sox2、Oct4、Nanog、Klf4基因?qū)?nèi)毒素血癥肺損傷病人的皮膚成纖維細(xì)胞重新編程為IPSCs,并建立和發(fā)展內(nèi)毒素血癥肺損傷病人特異性的干細(xì)胞系,旨在為內(nèi)毒素血癥肺損傷發(fā)病機(jī)制和治療藥物篩選的基礎(chǔ)研究以及細(xì)胞移植治療實(shí)驗(yàn)研究提供良好的細(xì)胞模型和更理想的細(xì)胞來源。1.雄性SD大鼠隨機(jī)分為2組：LPS組(n=10)大鼠腹腔注射LPS 10mg/kg;對照組(n=10)大鼠腹腔注射等量生理鹽水。注射24h后頸錐脫臼處死大鼠,取出心肌組織。Real-time PCR檢測心肌組織TNF-α、TLR4和IL-1β的表達(dá)水平；光、電鏡觀察心肌組織細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的變化；miRNA表達(dá)譜芯片分析大鼠心肌組織中差異表達(dá)的miRNA; Real-time PCR驗(yàn)證各候選miRNA的表達(dá)水平；生物信息學(xué)預(yù)測miRNA靶基因；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)對miRNA靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。2.選取內(nèi)毒素血癥肺損傷病人的皮膚組織,體外培養(yǎng)獲得病人皮膚成纖維細(xì)胞,采用慢病毒介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄的方法,將含有Sox2、Oct4、Nanog和Klf4四個(gè)因子的混合慢病毒轉(zhuǎn)染至內(nèi)毒素血癥肺損傷患者皮膚成纖維細(xì)胞,誘導(dǎo)出胚胎干細(xì)胞樣克隆。再通過堿性磷酸酶染色(alkaline phosphatase staining)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-PCR)、免疫熒光染色(immunofluorescent staining)和體內(nèi)畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法,根據(jù)人胚胎干細(xì)胞的特性,對獲得的病人皮膚成纖維細(xì)胞源性IPSC進(jìn)行鑒定。研究結(jié)果1. 內(nèi)毒素血癥大鼠心肌組織中TNF-α、TLR4和幾-1β的表達(dá)水平升高,且心肌組織細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷性變化。2.內(nèi)毒素血癥大鼠心肌組織差異表達(dá)顯著的miRNA:上調(diào)最明顯的10個(gè)miRNA包括miR-21-3p, miR-194-3p, miR-344a-3p, miR-465-3p, miR-3596c, miR-501-5p, miR-185-3, miR-877p, miR-186-3p和miR-3592；下調(diào)最明顯的10個(gè)miRNA包括miR-208b-3p, miR-141-3p, miR-547-3p, miR-28-5p, miR-199a-5p, miR-335, miR-322-5p, miR-532-5p, miR-3585-5p和miR-339-3p。3.在篩選出的20個(gè)候選miRNA中,提示有12個(gè)miRNA(包括7個(gè)上調(diào)1niRNA和5個(gè)下調(diào)1niRNA)可能與內(nèi)毒素血癥大鼠心肌細(xì)胞損傷和線粒體結(jié)構(gòu)破壞相關(guān)。4.在這些miRNA中,miR-194在內(nèi)毒素血癥大鼠心肌組織中表達(dá)顯著上調(diào),而miR-141顯著下調(diào)。5. miR-194表達(dá)上調(diào)的H9C2細(xì)胞株中Fmrl和Sumo2的表達(dá)顯著降低,證明miR-194可以在轉(zhuǎn)錄水平抑制Fmrl和Sumo2基因的表達(dá)。6. miR-141表達(dá)下調(diào)的H9C2細(xì)胞株中Myh10和Cyp26b1的表達(dá)顯著升高,證明miR-141可以在轉(zhuǎn)錄水平抑制Myh10和Cyp26b1基因的表達(dá)。7.原代培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞并重編程為IPSCs,獲得的ES樣細(xì)胞克隆AP染色呈陽性。8.細(xì)胞免疫熒光染色證實(shí)IPSCs表達(dá)人胚胎干細(xì)胞(hES)多能性基因標(biāo)記NANOG、SSEA3和Tra-1-81。9. Real-time PCR結(jié)果表明IPSCs高表達(dá)內(nèi)源多能基因Sox2、Oct4、Nanog和Klf4,與hES細(xì)胞基因表達(dá)譜相類似。10.經(jīng)過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分化形成的畸胎瘤組織可觀察到有三胚層結(jié)構(gòu)。結(jié)論1.內(nèi)毒素血癥大鼠心肌組織中TNF-α、TLR4和幾-1β的表達(dá)水平升高,且心肌組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷變化以及線粒體結(jié)構(gòu)破壞,表明內(nèi)毒素血癥心肌組織損傷大鼠模型成功建立。2.內(nèi)毒素血癥大鼠心肌組織miRNA表達(dá)差異顯著,其中miR-194表達(dá)顯著上調(diào)和miR-141表達(dá)顯著下調(diào)為首次發(fā)現(xiàn),可能在內(nèi)毒素血癥大鼠心肌損傷作用機(jī)制中起著重要作用,有可能是內(nèi)毒素血癥心肌損傷治療干預(yù)作用的新的潛在靶分子。3.以慢病毒作為Sox2、Oct4、Nanog和Klf4四個(gè)逆轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)移載體,能將內(nèi)毒素血癥肺損傷病人的皮膚成纖維細(xì)胞重新編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。4.重新編程的IPSCs在基因表達(dá)、表面抗原、克隆形態(tài)和堿性磷酸酶活性等方面都跟人ES細(xì)胞高度相似。5.將IPSCs移植至免疫缺陷大鼠體內(nèi)可以形成有三胚層結(jié)構(gòu)的畸胎瘤。6.首次成功建立內(nèi)毒素血癥肺損傷病人IPSCs,提示可為闡明肺損傷發(fā)病機(jī)制、臨床藥物篩選和有關(guān)細(xì)胞移植的實(shí)驗(yàn)研究提供良好的細(xì)胞模型和更理想的細(xì)胞來源。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R54

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本文編號(hào)：2349065