【摘要】：研究背景及目的心房顫動(房顫,AF)是一種臨床上最常見的心律失常之一,具有高發(fā)病率、高致殘率和療效不佳等特點,嚴重影響了患者的健康狀況與生活質(zhì)量。目前房顫的治療主要包括藥物治療、外科手術(shù)及導(dǎo)管射頻消融等,但房顫的治療效果不佳,消融后復(fù)發(fā)率高。這主要與房顫的發(fā)病機制尚未完全明確有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),心房重構(gòu)是房顫的重要發(fā)病機制,主要包括結(jié)構(gòu)重構(gòu)、電重構(gòu)和神經(jīng)重構(gòu)。其中,心臟神經(jīng)重構(gòu)是房顫觸發(fā)和維持的重要因素。心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)分為心臟內(nèi)在自主神經(jīng)系統(tǒng)和外在自主神經(jīng)系統(tǒng)。其中心臟內(nèi)在自主神經(jīng)重構(gòu)可促使房顫發(fā)作,房顫發(fā)作后使神經(jīng)重構(gòu)更為顯著,二者互相影響,促進房顫的維持,然而目前房顫自主神經(jīng)重構(gòu)的發(fā)生機制并不十分明了。MicroRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性非編碼小RNA,可以在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達進行調(diào)控。近年來,關(guān)于miRNA在房顫的神經(jīng)重構(gòu)中的作用有了新的認識。已有研究表明,miR-206通過調(diào)節(jié)超氧化物歧化酶的表達促進房顫心臟自主神經(jīng)重構(gòu),證明miR-206在房顫神經(jīng)重構(gòu)中發(fā)揮著重要作用。但miR-206通過調(diào)節(jié)其他通路對房顫自主神經(jīng)重構(gòu)的影響目前尚未具體闡明。磷酸鳥苷環(huán)化水解酶1(GCH1)基因編碼的Ⅰ型三磷酸鳥苷環(huán)化水解酶(guanosine triphosphate cyclohydrolase I,GTPCH I)是四氫生物喋呤(tetrahydrobiopterin,BH4)從頭合成的限速酶,而BH4是一氧化氮(NO)合成的必需輔因子。先前研究證實,在動物房顫模型中,心肌BH4含量顯著下降,促進房顫結(jié)構(gòu)重構(gòu)與電重構(gòu),而給予外源性BH4補充可以顯著降低房顫誘發(fā)率,證明了 BH4參與房顫的重構(gòu)過程。但目前尚沒有文獻報道BH4通路與房顫自主神經(jīng)重構(gòu)的關(guān)系。本研究通過建立犬的房顫模型,觀察GCH1在房顫犬心房組織中的表達變化,及miR-206對GCH1/BH4通路的影響。并且在犬心房組織中感染GCH1過表達慢病毒,觀察GCH1表達上調(diào)對神經(jīng)生長的作用。探討miR-206能否通過調(diào)控GCH1/BH4通路影響房顫自主神經(jīng)重構(gòu),為房顫的神經(jīng)重構(gòu)機制研究提供更多新的思考。材料與方法1.犬房顫模型建立健康成年雜種犬24只,雌雄不拘,體質(zhì)量10～20kg,隨機分為起搏組(n=6),起搏+miR-206過表達組(n=6),起搏+miR-206沉默組(n=6)和對照組(n=6)。前三組以400次/min持續(xù)右心房起搏4周。對照組操作同起搏組,但不打開起搏器開關(guān)。4周后在前三組犬右上脂肪墊(RSFP)中分別注射相應(yīng)慢病毒,處死對照組動物,取RSFP周圍小于0.5cm的心房組織。2.心肌細胞分離與培養(yǎng)取健康雜種幼犬心房組織,剪成1mm3左右的組織塊,用膠原酶和胰蛋白酶溶液充分消化后,將細胞懸液接種到培養(yǎng)皿中,放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。應(yīng)用差速貼壁法分離心肌細胞與心肌成纖維細胞。3.慢病毒的構(gòu)建構(gòu)建miR-206過表達、miR-206沉默、miRNA陰性對照、GCH1過表達、GCH1沉默及GCH1的陰性對照慢病毒,病毒滴度為1×109TU/ml。4.實驗分組及慢病毒感染4.1慢病毒的在體感染健康成年雜種犬24只,隨機分為miR-206過表達組、miR-206沉默組、GCH1過表達組和GCH1沉默組,每組6只。在RSFP中注射相應(yīng)慢病毒,2周后處死。上述三組起搏犬RSFP中注射相應(yīng)慢病毒,其中起搏組犬注射陰性對照慢病毒,2周后處死。4.2慢病毒的體外感染用miR-206過表達、miR-206沉默、GCH1過表達和GCH1沉默慢病毒分別感染各組心肌細胞48h,陰性對照慢病毒感染對照組細胞。5.電生理指標檢測心房有效不應(yīng)期(AERP)通過多通道程序刺激儀分別于轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染2周后對miR-206過表達組、miR-206沉默組、GCH1過表達和GCH1沉默組進行電生理檢查,基礎(chǔ)起搏刺激周長為150ms,S1S2呈8:1,步長5ms,AERP定義為S2不引起心房激動的最長S1S2間期。6.實時定量RT-PCR實時定量RT-PCR檢測起搏及慢病毒轉(zhuǎn)染后心肌組織和心肌細胞中GCH1和蛋白基因產(chǎn)物9.5(PGP9.5)mRNA的表達水平。7.免疫組化分析對GCH1過表達組、對照組及GCH1沉默組心肌組織中PGP9.5行免疫組化染色,計算神經(jīng)密度。8.Western blot 檢測Western blot檢測起搏及慢病毒轉(zhuǎn)染后心肌組織和心肌細胞中GCH1和PGP9.5的蛋白表達水平。9.熒光素酶分析報告通過熒光素酶分析報告驗證GCH1是miR-206的靶基因。10.RSFP中NO含量檢測通過硝酸還原酶法測定NO含量。波長550nm,光徑0.5cm,雙蒸水調(diào)零,測定各管OD值。11.RSFP中BH4含量檢測按照ELISA試劑盒說明書進行操作檢測,在450 n m波長下測量各孔的吸光度值,繪制標準曲線。結(jié)果1.在起搏組及miR-206過表達組中,PGP9.5 mRNA及蛋白表達較對照組均明顯上調(diào),在起搏+miR-206過表達組中PGP9.5表達上調(diào)最明顯。但在miR-206沉默組中,PGP9.5含量明顯下降。2.miR-206過表達組AERP明顯縮短,而miR-206沉默組AERP延長。GCH1過表達組AERP明顯延長,而GCH1沉默組AERP縮短。3.熒光素酶報告驗證了 GCH1是miR-206的靶基因。miR-206過表達組中GCH1mRNA及蛋白表達均下降,而miR-206沉默組中GCH1mRNA及蛋白含量增加。4.miR-206過表達組RSFP中BH4和NO含量下調(diào),而miR-206沉默組中BH4和NO水平明顯升高。GCH1過表達組中BH4和NO含量明顯增加,而GCH1沉默使BH4和NO含量減少。5.GCH1過表達組中PGP9.5 mRNA及蛋白表達均明顯下調(diào),神經(jīng)密度下降。而GCH1沉默組中PGP.5表達上調(diào),神經(jīng)密度增加。結(jié)論MiR-206通過調(diào)控靶基因GCH1發(fā)揮促進房顫心臟自主神經(jīng)重構(gòu)的作用。GCH1過表達通過增加BH4含量抑制房顫心臟自主神經(jīng)重再生及房顫的發(fā)生。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R541.75

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1 魏金秋;GCH1通過BH4通路對快速心房起搏犬自主神經(jīng)重構(gòu)的影響[D];山東大學;2017年

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本文編號：2333972