【摘要】：研究背景《Lancet》發(fā)表全球疾病負擔(dān)研究結(jié)果指出,在全球人群235種疾病的死亡原因中,缺血性心臟病居于首位。在過去的幾十年間,盡管隨著經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)、冠狀動脈搭橋術(shù)、抗血小板和抗凝藥物等治療方法有了突破,梗死阻塞的冠脈很快得到再通,但在缺血心肌恢復(fù)再灌注后,反而引起心臟功能的惡化和心肌的損傷,即缺血再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)損傷。I/R損傷導(dǎo)致心臟重構(gòu),是引起心力衰竭的主要原因,導(dǎo)致患者遠期死亡率增加和生活質(zhì)量下降。引起心肌I/R損傷的機制較多,但目前仍然不是非常明確。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic Reticulum,ER)應(yīng)激是導(dǎo)致心肌I/R損傷的重要機制之一,缺血缺氧等各種刺激因素作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),導(dǎo)致其功能紊亂,從而引起ER應(yīng)激,ER應(yīng)激參與了缺血再灌注病理生理變化過程中的多步反應(yīng),過久或者過強均會導(dǎo)致細胞的死亡,在小鼠I/R損傷模型的心肌細胞內(nèi)可檢測到ER應(yīng)激標(biāo)志物的升高。研究表明,ER應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡是導(dǎo)致心肌缺血再灌注損傷的重要病理生理機制之一,減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以保護心肌缺血再灌注損傷,因此,可通過調(diào)控ER應(yīng)激及其誘導(dǎo)的凋亡來干預(yù)心肌I/R損傷。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(Silent information regulator 2 type 1,SIRT1)是哺乳動物中重要的NAD+依賴性去乙�；�,參與代謝、細胞生存、生物壽命的調(diào)節(jié)等重要的生理和病理過程。研究表明,激活SIRT1具有保護心肌損傷的作用,可以將其視為治療心肌I/R的一個新的靶點。然而,SIRT1在心血管疾病的預(yù)防和治療的確切作用仍知之甚少。ER應(yīng)激和SIRT1信號通路目前均被認為是決定心肌細胞的生存與死亡的重要因素,研究發(fā)現(xiàn),兩者之間存在密切的聯(lián)系,但它們在心肌I/R中的作用機制尚不明確。自噬在心肌缺血／再灌注中具有重要的作用,既往對I/R損傷的研究機制大部分聚焦在心肌壞死和凋亡,但最近研究表明,自噬功能紊亂可能使心臟更易發(fā)生缺血／再灌注損傷以及心梗后心臟重塑,甚至觸發(fā)細胞凋亡及壞死的發(fā)生,說明自噬對心臟有害。然而似乎矛盾的是,更多的研究表明自噬在心肌缺血／再灌注損傷的缺血階段時對心肌具有保護作用。鑒于此,自噬在心肌I/R損傷中作用需要進一步探討。目前關(guān)于心肌細胞自噬和凋亡的相互關(guān)系已成為一個研究熱點。研究表明自噬具有抑制凋亡保護心肌細胞的作用。自噬的調(diào)節(jié)是一個非常復(fù)雜的過程,其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子機制非常復(fù)雜,AMPK/mTOR信號通路是目前比較明確的一個,mTOR被認為是哺乳動物中自噬的負調(diào)節(jié)物,能接受多種上游信號,細胞在缺血缺氧狀態(tài)時激活A(yù)MPK,通過抑制mTOR而誘導(dǎo)自噬,自噬與AMPK/mTOR信號通路的相互反饋調(diào)控作用能夠促進細胞的存活。蘿卜硫素(Sulforaphane, SFN)是一種來源于西蘭花、芥藍等十字花科植物的異硫氰酸鹽,作為一種間接抗氧化劑能夠誘導(dǎo)激活Ⅱ相解毒酶和抗氧化基因,從而具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗腫瘤和心血管保護的作用。被認為是截至目前發(fā)現(xiàn)的所有天然抗癌物質(zhì)里,效力最強、效果最好的活性成分。綜上所述,我們提出假說：1、蘿卜硫素預(yù)處理通過激活SIRT1抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴的凋亡保護心肌細胞缺氧／復(fù)氧損傷；2、蘿卜硫素預(yù)處理通過AMPK/mTOR通路誘導(dǎo)自噬抑制凋亡保護小鼠心肌缺血／再灌注損傷。本實驗擬建立離體新生乳鼠心肌細胞缺氧／復(fù)氧(Hypoxia/reoxygenation,H/R)模型及在體小鼠心肌I/R模型,來探討蘿卜硫素對心肌細胞缺血／再灌注損傷的保護作用及可能的機制,從而為其今后應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。目的1.建立乳鼠心肌細胞H/R模型,離體水平證實蘿卜硫素預(yù)處理激活SIRT1信號通路抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴的凋亡保護心肌細胞缺氧／復(fù)氧損傷；2.建立乳鼠心肌細胞H/R模型和小鼠心肌I/R模型,整體水平證實蘿卜硫素預(yù)處理通過AMPK/mTOR通路誘導(dǎo)自噬抑制凋亡保護小鼠心肌細胞缺血/再灌注損傷。對象與方法第一部分本部分實驗采用新生乳鼠(1～2 d)分離培養(yǎng)原代心肌細胞,制備缺氧／復(fù)氧模型模擬缺血／再灌注。實驗分為4步：第1步,探索最佳H/R造模時間。將分離培養(yǎng)后的心肌細胞隨機分為5組：Con(對照組)；H3/R3組(缺氧3小時／復(fù)氧3小時)；H3/R6組、H3/R9組；H3/R12組。通過倒置顯微鏡觀察心肌細胞搏動和形態(tài)學(xué)變化,MTS法檢測心肌細胞活性,Elisa試劑盒檢測細胞培養(yǎng)液中LDH活性檢測心肌細胞損傷程度。第2步,探索SFN保護原代心肌細胞H/R損傷的最佳藥物濃度。將培養(yǎng)的心肌細胞分為6組：Con組；缺氧／復(fù)氧組(H/R)：缺氧培養(yǎng)3小時,復(fù)氧培養(yǎng)3小時；不同濃度SFN預(yù)處理組(0.1μ,M,0.5μM,1μM,5μM)；通過MTS法檢測心肌細胞活性,Elisa試劑盒檢測細胞培養(yǎng)液中細胞內(nèi)丙二醛(Malonydialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)檢測SFN對原代心肌細胞H/R損傷的保護作用。第3步,探索SFN是否具有通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴的凋亡保護心肌H/R損傷。將心肌細胞分為4組：Con組；SFN組：5μMSFN加入正常孵育條件下的心肌細胞中；H/R組：缺氧培養(yǎng)3小時,復(fù)氧培養(yǎng)3小時；SFN+H/R組：5μMSFN提前1h在缺氧復(fù)氧造模前加入心肌細胞。通過TUNEL法檢測凋亡指數(shù),Caspase-3活性檢測試劑盒檢測凋亡蛋白酶Caspase-3活性,免疫印跡法(Western blot)檢測抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax表達水平觀察細胞凋亡水平、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志蛋白GRP78、CHOP和Cleaved caspase-12蛋白判斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平。第4步,探索SFN是否通過激活SIRT1通路抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴的凋亡保護心肌H/R損傷。將心肌細胞分為6組：Con組；EX-527組(E)：抑制劑1μMEX-527提前1小時加入正常培養(yǎng)的原代心肌細胞中；H/R組：原代心肌細胞缺氧培養(yǎng)3小時,復(fù)氧培養(yǎng)3小時；E+H/R組：1μMEX-527在H/R造模前加入心肌細胞培養(yǎng)液中；SFN+H/R組；SFN+E+H/R組。通過JC-1探針檢測線粒體膜電位,MTS檢測細胞活性,免疫印跡法檢測SIRT1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(GRP78、CHOP、Cleaved caspase-12)、抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的表達水平。第二部分本部分實驗通過培養(yǎng)原代心肌細胞制備H/R模型以及采用野生型單一雄性C57BL/6小鼠構(gòu)建小鼠心肌缺血／再灌注損傷模型。實驗分為5步：第1步,探索H/R能否在原代心肌細胞中誘導(dǎo)出自噬和凋亡現(xiàn)象,并探索與造模時間的關(guān)系。培養(yǎng)的原代心肌細胞分為6組：Con組(對照組)；H3/R3組；H3/R6組；H3/R9組；H3/R12組；H3/R24組。通過免疫印跡法(Western blot)檢測LC3-Ⅱ蛋白表達自噬水平；通過TUNEL法檢測細胞凋亡率。第2步,探索自噬是否能抑制凋亡保護心肌細胞H/R損傷。培養(yǎng)的原代心肌細胞分為4組：Con組；缺氧／復(fù)氧組(H/R)：原代心肌細胞缺氧培養(yǎng)3小時,復(fù)氧培養(yǎng)3小時；3-MA組：自噬抑制劑3-MA提前1h在缺氧／復(fù)氧造模前加入心肌細胞；Rapa組：自噬激動劑Rapamycin提前1h在缺氧／復(fù)氧造模前加入心肌細胞；通過自噬雙標(biāo)腺病毒mRFP-GFP-LC3和LC3-Ⅱ蛋白、P62蛋白表達檢測自噬流；通過TUNEL法檢測凋亡指數(shù)及Bcl-2蛋白、Bax蛋白表達水平檢測凋亡水平。第3步,探索SFN能否促進自噬抑制凋亡保護原代心肌細胞H/R損傷。原代心肌細胞分為5組：Con組；缺氧／復(fù)氧組(H/R)；SFN組：5μMSFN+缺氧／復(fù)氧組；SFN+3-MA組：3-MA+SFN+H/R; SFN+Rapa組：Rapa+SFN+H/R;通過自噬雙標(biāo)腺病毒]mRFP-GFP-LC3和LC3-Ⅱ蛋白、P62蛋白表達檢測自噬流；通過TUNEL法檢測凋亡指數(shù)及Bcl-2蛋白、Bax蛋白表達水平檢測凋亡水平。第4步,在體水平上SFN能否促進自噬保護小鼠心肌I/R損傷誘導(dǎo)的凋亡。小鼠分為7組：假手術(shù)組(Sham);缺血／再灌注組(I/R)：缺血45min,再灌注2h；SFN組：5μM SFN在缺血／再灌注之前24h和1h提前腹腔注射入體內(nèi)；Wor組：自噬抑制劑Wortmannin在缺血／再灌注之前24h和1h提前腹腔注射入體內(nèi)；Rapa組;SFN+Wor組;SFN+Rapa組。通過投射電鏡觀察自噬小體和Western blot檢測LC3-Ⅱ蛋白、P62蛋白表達檢測自噬流；通過TUNEL法檢測凋亡指數(shù)及Bcl-2蛋白、Bax蛋白表達水平表示凋亡水平。第5步,SFN通過AMPK/mTOR促進自噬保護H/R損傷誘導(dǎo)的凋亡。心肌細胞分為5組：Con組；I/R組；SFN組；CC組：AMPK抑制劑Compound C組提前1h在缺氧／復(fù)氧造模前加入心肌細胞；SFN+CC組。通過自噬雙標(biāo)腺病毒mRFP-GFP-LC3和LC3-Ⅱ蛋白、P62蛋白表達檢測自噬流；通過Western blot檢測AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR蛋白表達水平。采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,所有計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(x±s),首先對各組數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗和單因素方差分析,方差齊時,多重比較選用最小顯著差值法(Least-significant Difference, LSD),若方差不齊時,采用近似F檢驗(Welch法),多重比較采用Dunnett's T3方法,以P0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果第一部分3.1缺氧/復(fù)氧時間對原代心肌細胞形態(tài)的影響倒置相差顯微鏡觀察新接種的心肌細胞形態(tài)呈球形懸浮于培養(yǎng)液中,培養(yǎng)4h后開始貼壁生長,變?yōu)閳A形或者橢圓形,后變?yōu)樗笮?并逐漸伸出偽足,變?yōu)椴灰?guī)則形狀。逐漸伸出偽足呈星形,交織成網(wǎng)。細胞搏動呈同步性,收縮明顯有力。H3/R3組細胞存活減少,細胞搏動紊亂,隨著復(fù)氧時間的延長,H3R6組、H3R9組心肌細胞存活率減少,細胞搏動微弱,鏡下可發(fā)現(xiàn)部分死亡細胞漂浮于培養(yǎng)液表面,H3R12組細胞活力最差,部分細胞無搏動。3.2不同缺氧/復(fù)氧時間對原代心肌細胞損傷的影響利用MTS法檢測原代心肌細胞存活率,結(jié)果顯示,與對照組相比,各缺氧／復(fù)氧造模組的細胞活性率均下降,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；與H3/R3組比較,其他缺氧／復(fù)氧造模組均具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)。同時我們用LDH試劑盒檢測了細胞培養(yǎng)液的LDH活性,結(jié)果顯示,與對照組比較,H3/R3的活性增高,各缺氧／復(fù)氧造模組LDH活性隨著復(fù)氧時間的延長明顯增高,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。H3/R6組與H3/R9組比較,兩者無顯著差異(P=0.125)；H3/R9組與H3/R12組比較,兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.288)。表明復(fù)氧后期,細胞損傷及存活率的下降慢慢減小,表明H3/R3是最佳的造模時間。3.3蘿卜硫素保護原代心肌細胞H/R損傷的最佳藥物濃度利用MTS法檢測原代心肌細胞存活率,結(jié)果顯示,與對照組相比,H/R組的細胞存活率明顯下降,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；與H/R組比較,各濃度蘿卜硫素組均可以改善原代心肌細胞缺氧／復(fù)氧造成的損傷,均具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)；尤以5μM效果最明顯(88.61±2.73%vs.52.11±2.05%)。分別應(yīng)用MDA和SOD檢測試劑盒檢測體外培養(yǎng)各組心肌細胞中MDA含量和SOD活性,結(jié)果顯示,與對照組細胞相比,H/R組心肌細胞的MDA增加(2.94±0.82 vs.0.72±0.06,P0.01),SOD減少(76.05±14.89 vs.142.21±7.55),差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。各濃度蘿卜硫素(0.5μM,1μM,5μM)預(yù)處理組與H/R組相比,MDA降低,SOD增加,且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),尤其以5μM蘿卜硫素組明顯。3.4蘿卜硫素預(yù)處理減弱原代心肌細胞H/R誘導(dǎo)的凋亡我們利用TUNEL法進行染色觀察細胞凋亡情況,結(jié)果顯示,與對照組相比,H/R組和H/R+SFN組細胞凋亡指數(shù)增加,差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),而單純SFN組凋亡指數(shù)稍降低,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與H/R組比較,H/R+SFN組細胞凋亡指數(shù)降低,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(31.13±3.70% vs.45.90±3.45%,P0.01)。我們應(yīng)用Caspase-3試劑盒檢測各組細胞的Caspase-3活性,結(jié)果顯示,單純SFN組凋亡指數(shù)稍降低,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與正常對照組比較,H/R組細胞Caspase-3活性顯著升高(P0.001)。單純SFN組及SFN+H/R組與H/R組兩兩比較,Caspase-3活性較H/R組均顯著降低(P0.001)。3.5蘿卜硫素預(yù)處理抑制原代心肌細胞H/R損傷所致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴的凋亡我們應(yīng)用Western blot法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志蛋白及凋亡蛋白表達,結(jié)果顯示：與對照組相比,H/R組的3個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白(GRP78、CHOP、Cleaved caspase-12)表達均增強,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.01)。與H/R組比較,單純SFN預(yù)處理組和SFN+H/R組的三個ER應(yīng)激標(biāo)志蛋白表達降低,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。我們同時研究了抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的表達,結(jié)果顯示,與對照組相比,H/R組和H/R+SFN組的Bcl-2/Bax表達比值均有下降,差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),而單純SFN組Bcl-2/Bax表達比值稍有增高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與H/R組比較,H/R+SFN組的Bcl-2/Bax表達比值升高,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(0.72±0.06 vs.0.53±0.07,P0.01)。3.6蘿卜硫素預(yù)處理激活SIRT1通路保護心肌H/R損傷我們用Western blot檢測了SIRT1蛋白在各組間的表達,結(jié)果顯示,與對照組相比,H/R組差異不具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。而單純SFN組和H/R+SFN組均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)。我們進一步檢測了各組的SIRT1活性,結(jié)果顯示,與對照組相比,H/R組SIRT1活性明顯減低(40.67±5.50% vs.99.00±4.00%),差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與H/R組相比較,H/R+SFN組的SIRT1活性明顯升高,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)。3.7蘿卜硫素預(yù)處理改善線粒體膜電位,EX-527可以阻斷此作用我們采用JC-1熒光探針應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡檢測各實驗組的線粒體膜電位(△Ψm),結(jié)果顯示,與對照組相比,H/R組線粒體膜電位明顯減低,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與H/R組比較,SFN預(yù)處理可以改善線粒體膜電位(0.71±0.03 vs.0.36±0.03),均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)。與H/R+SFN組比較,H/R+SFN+EX-527組線粒體膜電位明顯減低(P0.01)。我們也研究了EX-527對原代心肌細胞存活率的影響,結(jié)果顯示,與對照組相比,EX-527和H/R組細胞存活率明顯減低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),表明H/R模型造模成功；同時也表明EX-527有部分毒性作用。與H/R組比較,蘿卜硫素預(yù)處理可以改善細胞存活率(87.05±3.37%vs.52.67±3.05%),具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。與H/R+SFN組比較,]H/R+SFN+EX-527組細胞存活率明顯減低,表明蘿卜硫素保護細胞的作用被EX-527阻斷。3.8蘿卜硫素預(yù)處理抑制原代心肌細胞H/R損傷所致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴的凋亡我們加入了SIRT1抑制劑后檢測各組的蛋白表達,想通過阻斷SIRT1信號通路進一步驗證我們的假設(shè),結(jié)果顯示：與對照組相比,H/R組的3個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白(GRP78、CHOP、Cleaved caspase-12)表達均增強,均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P均0.01)。與H/R組比較,SFN+H/R組均明顯減低上述各值,具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)。與SFN+H/R組比較,H/R+SFN+EX-527組數(shù)值明顯增高(P0.01)。我們同時研究了抗凋亡蛋白Bcl-2/促凋亡蛋白Bax的表達與EX-527的關(guān)系,結(jié)果顯示,與對照組相比,H/R組的Bcl-2/Bax表達比值均有下降(0.27±0.03 vs.0.63±0.04),差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。與H/R組比較,H/R+SFN組的Bcl-2/Bax表達比值升高,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(0.49±0.04 vs.0.27±0.03,P0.01)。與SFN+H/R組比較,H/R+SFN+EX-527組數(shù)值明顯降低(0.29±0.03 vs.0.49±0.04,P0.01)。3.9蘿卜硫素預(yù)處理通過SIRT1通路保護原代心肌細胞H/R損傷我們研究蘿卜硫素是否通過激活SIRT1通路抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴的凋亡,結(jié)果顯示,與對照組相比,H/R組差異不具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與H/R組比較,H/R+SFN組兩者間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；而與H/R+SFN組比較,H/R+SFN+EX-527組數(shù)值明顯降低,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。我們再次檢測了各組的SIRT1活性,結(jié)果顯示,與對照組相比,H/R組SIRT1活性明顯減低(40.67±5.51% vs.99.00±4.00%),差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與H/R組比較,H/R+SFN組兩者間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；而與H/R+SFN組比較,H/R+SFN+EX-527組數(shù)值明顯降低(P0.01),表明蘿卜硫素是通過SIRT1通路保護心肌H/R傷的作用。第二部分3.1 H/R能在原代心肌細胞中誘導(dǎo)出自噬和凋亡為了解心肌細胞H/R損傷是否可誘導(dǎo)自噬,我們用Western blot檢測自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ的水平。結(jié)果顯示,與對照組相比,各H/R造模組的LC3-Ⅱ表達比值均有明顯升高,H3/R3組自噬水平達到頂峰,(P0.01)；與H3/R3組比較,其他缺氧／復(fù)氧造模組隨著復(fù)氧時間的延長,自噬水平逐漸下降(P0.01)。我們同時利用TUNEL法檢測了凋亡指數(shù),結(jié)果顯示：與對照組相比,H3/R3組的凋亡率最高,隨著復(fù)氧時間的延長,凋亡指數(shù)逐漸下降,呈時間依賴性,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；H3/R3時自噬和凋亡均最強,便于研究其兩者相互關(guān)系,所以我們選擇H3/R3作為最佳造模時間。3.2自噬能保護原代心肌細胞H/R損傷誘導(dǎo)的凋亡為了研究自噬和凋亡的關(guān)系,我們首先利用Western blot檢測了自噬標(biāo)志蛋白,結(jié)果顯示,與對照組相比,H/R組的LC3-Ⅱ蛋白表達水平明顯升高,其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與H/R組比較,自噬抑制劑3-MA明顯抑制LC3-Ⅱ水平,升高P62水平,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。而自噬激動劑Rapa導(dǎo)致LC3-Ⅱ水平明顯升高,P62降低,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。各組凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達結(jié)果顯示,與對照組相比,H/R組的Bcl-2水平明顯降低,Bax水平明顯升高,其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與H/R組比較,3-MA組Bcl-2水平明顯下降,Bax水平增加(P0.01)。而Rapa組Bcl-2水平明顯升高,Bax水平下降(P0.01)。我們同時利用自噬雙標(biāo)腺病毒mRFP-GFP-LC3,結(jié)果顯示,與對照組相比,H/R組的GFP/mRFP及mRFP水平明顯升高,其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與H/R組比較,3-MA組GFP/mRFP及mRFP水平均下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。而Rapa組則相反,GFP/mRFP和mRFP均增高,均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。我們同時應(yīng)用TUNEL法檢測了細胞凋亡,結(jié)果顯示：與對照組相比,H/R組的凋亡指數(shù)明顯升高,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；與H/R組比較,自噬抑制劑3-MA組凋亡指數(shù)水平明顯增高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。而自噬激動劑Rapa組水平出現(xiàn)明顯下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.3 SFN能在原代心肌細胞H/R損傷時促進自噬保護凋亡我們接著探索SFN是否能誘導(dǎo)自噬保護凋亡,結(jié)果顯示,與對照組相比,H/R組的LC3-Ⅱ水平明顯升高,其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與H/R組比較,SFN組的LC3-Ⅱ的水平明顯升高,P62明顯減低,其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與SFN組比較,SFN+3-MA組明顯抑制LC3-Ⅱ水平下降,P62水平升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。而SFN+Rapa組LC3-Ⅱ水平稍微升高,P62水平稍降低,差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。各組凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,H/R組的Bcl-2水平明顯降低,Bax水平明顯升高,其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與H/R組比較,SFN組Bcl-2水平明顯升高,Bax水平明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。與SFN組比較,SFN+3-MA組的Bcl-2明顯下降,而Bax明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),而SFN+Rapa組Bcl-2水平稍微升高,Bax稍微降低,差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。我們同時利用自噬雙標(biāo)腺病毒mRFP-GFP-LC3檢測自噬,與對照組相比,H/R組的GFP/mRFP和mRFP水平明顯升高(P0.05)；與H/R組比較,SFN組GFP/mRFP和mRFP水平明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。與SFN組比較,SFN+3-MA組GFP/mRFP和mRFP水平出現(xiàn)下降,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與SFN組比較,SFN+Rapa組GFP/mRFP和mRFP升高,差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。我們同時應(yīng)用TUNEL法檢測了細胞凋亡,結(jié)果顯示：與對照組相比,H/R組的凋亡指數(shù)明顯升高,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。與H/R組比較,SFN組凋亡指數(shù)明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。與SFN組比較,SFN+3-MA組凋亡指數(shù)水平升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而SFN+Rapa組凋亡指數(shù)水平出現(xiàn)下降,差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.4 SFN預(yù)處理可減少小鼠缺血/再灌注損傷后心肌梗死面積蘿卜硫素預(yù)處理后檢測小鼠心肌梗死面積,結(jié)果顯示,與對照組相比,I/R組的INF/AAR和INF/LV的水平均明顯升高,其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與I/R組比較,SFN組的INF/AAR和INF/LV的水平明顯減低,其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與I/R組比較,Wor組的INF/AAR和INF/LV的水平明顯升高,其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而Rapa組INF/AAR和INF/LV明顯升高,其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與SFN組比較,SFN+Wor組INF/AAR和INF/LV水平升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。而SFN+Rapa組INF/AAR和INF/LV水平稍降低,差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.5 SFN預(yù)處理可減少缺血/再灌注損傷后血清CK及LDH的活性Elisa試劑盒檢測再灌注2小時后小鼠血清CK及LDH的活性,結(jié)果顯示,與對照組相比,I/R組的CK和LDH的水平均明顯升高,其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與I/R組比較,SFN組的CK、LDH均明顯減低,其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與I/R組比較,Wor組CK、LDH的水平明顯升高,其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而Rapa組CK、LDH的水平均明顯降低,,其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與SFN組比較,SFN+Wor組CK、LDH水平均升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。而SFN+Rapa組CK、LDH均降低,差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.6 SFN預(yù)處理促進自噬保護小鼠心肌缺血/再灌注損傷誘導(dǎo)的凋亡我們接著探索在動物層面SFN是否具有誘導(dǎo)自噬保護凋亡的作用,結(jié)果顯示,與對照組相比,I/R組的LC3-Ⅱ水平明顯升高,其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與I/R組比較,SFN組的LC3-Ⅱ的水平明顯升高,P62明顯減低,其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與I/R組比較,Wor組的LC3-Ⅱ的水平明顯降低,P62明顯升高,其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而Rapa組LC3-Ⅱ的水平明顯升高,P62明顯減低,其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與SFN組比較,SFN+Wor組明顯抑制LC3-Ⅱ水平下降,P62水平升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。而SFN+Rapa組LC3-Ⅱ水平稍微升高,P62水平稍降低,差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。各組凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax,結(jié)果顯示,與對照組相比,I/R組的Bcl-2和Bax的水平均明顯升高,其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與I/R組比較,SFN組的Bcl-2的水平明顯升高,Bax明顯減低,其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與UR組比較,Wor組Bcl-2的水平明顯降低,Bax明顯升高,其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而Rapa組Bcl-2的水平明顯升高,Bax明顯減低,其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與SFN組比較,SFN+Wor組Bcl-2水平下降,Bax水平升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。而SFN+Rapa組Bcl-2水平稍微升高,Bax水平稍降低,差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。我們同時利用投射電鏡觀察自噬小體個數(shù),結(jié)果顯示,與對照組相比,I/R組的自噬小體水平明顯升高,其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與I/R組比較,SFN組和Rapa組自噬小體水平明顯升高,Wor組明顯減低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。與SFN組比較,SFN+Wor組自噬小體水平出現(xiàn)下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與SFN組比較,SFN+Rapa組自噬小體增多(P0.05)。我們同時應(yīng)用TUNEL法檢測了細胞凋亡,結(jié)果顯示：與對照組相比,I/R組的凋亡指數(shù)明顯升高,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。與I/R組比較,SFN組和Rapa組凋亡指數(shù)明顯降低,而Wor組凋亡指數(shù)稍微增高(P0.01)。與SFN組比較,SFN+Wor組凋亡指數(shù)水平升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而SFN+Rapa組凋亡指數(shù)水平出現(xiàn)下降,差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.7 SFN通過AMPK/mTOR促進自噬抑制凋亡保護H/R損傷我們接著探討了SFN誘導(dǎo)自噬的信號通路,結(jié)果顯示,與對照組相比,H/R組LC3-Ⅱ水平均明顯升高,其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與H/R組比較,SFN組的LC3-Ⅱ水平明顯升高,P62明顯降低；SFN+CC組明顯抑制LC3-Ⅱ水平,而P62水平提高,自噬水平下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。我們同時利用自噬雙標(biāo)腺病毒mRFP-GFP-LC3B檢測自噬點數(shù),結(jié)果顯示,與對照組相比,H/R組的GFP/mRFP和mRFP水平明顯升高(P0.05)；與H/R組比較,SFN組和Rapa組GFP/mRFP和mRFP水平明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。與H/R組比較,3-MA組GFP/mRFP和mRFP水平降低(P0.05)。與Rapa組與SFN組比較,SFN+3-MA組GFP/mRFP和mRFP水平出現(xiàn)下降,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與SFN組比較,SFN+Rapa組GFP/mRFP和mRFP升高,差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。同時檢測了各組p-AMPK/AMPK和p-mTOR/mTOR蛋白表達比值,結(jié)果顯示,與對照組相比,H/R組的p-AMPK/AMPK明顯升高,而p-mTOR/mTOR降低,其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與SFN組比較,CC組和SFN+CC組的p-AMPK/AMPK明顯降低,而p-mTOR/mTOR升高,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.蘿卜硫素預(yù)處理通過激活SIRT抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴的凋亡保護心肌細胞缺氧復(fù)氧損傷；2.蘿卜硫素預(yù)處理通過AMPK/mTOR通路誘導(dǎo)自噬抑制凋亡保護小鼠心肌細胞缺血/再灌注損傷。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R54

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本文編號：2329137