【摘要】：心肌梗死(myocardial infarction,MI)是冠心病的一種十分兇險的臨床類別,具有發(fā)病急、病情進(jìn)展快、程度重、近期和遠(yuǎn)期并發(fā)癥多及預(yù)后差等特點(diǎn),約50%的心血管系統(tǒng)疾病死亡事件可歸因于MI。隨著經(jīng)濟(jì)、社會等全球化進(jìn)程的加速,MI已迅速成為世界第一位的死亡原因。MI后心律失常、心力衰竭等并發(fā)癥是其不良預(yù)后的主要原因,其中心律失常尤其是各種形式的惡性室性心律失常(ventricular arrhythmia, VAs)是MI患者死亡的主要原因；有研究資料顯示,大于50%的MI存活患者死于VAs事件。因此,越來越多的臨床醫(yī)師和科研工作者致力于MI后VAs發(fā)生機(jī)制及防治策略的探討。隨著近年來研究的逐步深入,心臟重構(gòu)被認(rèn)為是MI后一系列并發(fā)癥發(fā)生的主要原因,其包含心肌重構(gòu)、縫隙連接重構(gòu)、自主神經(jīng)重構(gòu)及電重構(gòu)等。研究提示,由縫隙連接介導(dǎo)的電沖動是維持正常心電功能的先決條件,其中心室肌細(xì)胞主要表達(dá)縫隙連接蛋白43(connexin43,Cx43),其相鄰細(xì)胞之間的電耦聯(lián)即由Cx43所組成的縫隙連接通道主導(dǎo)；各種病理狀態(tài)下,Cx43的表達(dá)數(shù)量、分布方式和功能發(fā)生改變,即縫隙連接重構(gòu),均可能顯著影響電沖動在心室肌細(xì)胞間傳導(dǎo)的連續(xù)性、一致性,從而增加心律失常的誘發(fā)傾向。MI后交感神經(jīng)重構(gòu)與心律失常的關(guān)系近年來引起廣大臨床醫(yī)生和科研人員的普遍關(guān)注。MI后心臟發(fā)生去神經(jīng)纖維支配、神經(jīng)出芽再生和交感神經(jīng)過分再生和高支配,即為交感神經(jīng)重構(gòu)；在受損組織修復(fù)的同時這種非正常的神經(jīng)重構(gòu)增重了MI后心肌組織的電生理異質(zhì)性,導(dǎo)致VAs易感性的增大。研究發(fā)現(xiàn),炎癥反應(yīng)與MI后交感神經(jīng)再生重構(gòu)關(guān)系密切；巨噬細(xì)胞作為炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵一環(huán),可分泌神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF),而NGF是神經(jīng)再生的重要調(diào)控因素之一。巨噬細(xì)胞在不同環(huán)境條件刺激下,可發(fā)生表型轉(zhuǎn)化,從而表現(xiàn)出功能截然不同的兩個細(xì)胞亞群,即經(jīng)典激活的M1型和替代性激活的M2型,二者是巨噬細(xì)胞功能上連續(xù)變化的兩個極端,甚至互相抑制。M1型巨噬細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)的啟動和維持；而M2型巨噬細(xì)胞生成抗炎因子,終止破壞性的炎癥反應(yīng),參與組織修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn),MI早期M1型巨噬細(xì)胞起主導(dǎo)作用。因此在MI發(fā)生后盡早有效抑制M1型巨噬細(xì)胞啟動的炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)NGF分泌表達(dá),從而調(diào)控MI后交感神經(jīng)再生重構(gòu),可能能夠有效的防治MI后惡性VAs的發(fā)生、發(fā)展。ARB (angiotensin receptor blocker,ARB)在MI患者中的應(yīng)用主要基于其可延緩MI后左心室重構(gòu)、改善心功能等,其對MI后心肌組織心電生理特性影響如何,目前相關(guān)研究較少。LIFE試驗、TRACE試驗及AFFIRM試驗等大型臨床試驗觀察到,心功能不全和高血壓病左心室肥厚患者使用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin-converting enzyme inhibitor,ACEI)和／或ARB后,新發(fā)房顫的發(fā)生率顯著降低,提示二者均可能存在一定的抗心律失常作用；而有研究顯示上述作用可能與ACEI和／或ARB可改善心房縫隙連接的重構(gòu)有關(guān),但二者對于MI后VAs的影響及具體機(jī)制的相關(guān)研究尚少。因此,我們推測MI后早期ARB干預(yù)可有效調(diào)控MI后縫隙連接重構(gòu),為MI后惡性VAs的防治提供新的理論依據(jù)和基礎(chǔ)實(shí)驗支持。羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑(hydroxy methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor),又稱為他汀類藥物,在臨床上廣泛用于患者血脂水平的調(diào)節(jié)；其同時具有抗血小板聚集、抑制單核-巨噬細(xì)胞的粘附和分泌、抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移、抗心律失常等調(diào)脂之外的多種作用；其中就其如何發(fā)揮抗心律失常作用目前相關(guān)的研究較少；新近研究證實(shí)其可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型自M1型向M2型方向轉(zhuǎn)變。因此,我們推測MI后早期他汀類藥物干預(yù)可通過影響巨噬細(xì)胞的表型和功能來調(diào)控炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)NGF的分泌表達(dá),從而改善MI后交感神經(jīng)再生重構(gòu),可能成為MI后惡性VAs防治的有效手段之一在課題組既往研究基礎(chǔ)上,本研究擬通過建立MI動物模型,進(jìn)一步證實(shí)縫隙連接重構(gòu)、交感神經(jīng)重構(gòu)與VAs的關(guān)系,探討MI后巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化與心臟交感神經(jīng)重構(gòu)的關(guān)系；并給予ARB纈沙坦、他汀類代表藥物阿托伐他汀干預(yù),以期揭示二者抗心律失常作用及可能機(jī)制,為降低MI后VAs的發(fā)生提供新的思路,并為臨床上MI后ARB、他汀類藥物的早期應(yīng)用提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。為明確闡述以上問題,本課題通過以下兩個部分進(jìn)行探討：第一部分纈沙坦對心肌梗死后室性心律失常的影響及機(jī)制的實(shí)驗研究目的：明確MI后縫隙連接重構(gòu)與VAs的關(guān)系,并行ARB纈沙坦干預(yù)研究,確定其具有抗心律失常作用,以期為MI后VAs的防治及ARB的臨床拓展應(yīng)用提供新的思路。方法：SD大鼠隨機(jī)分成3組：假手術(shù)組(Sham組),心肌梗死組(MI組),ARB纈沙坦干預(yù)心肌梗死組(ARB組)。采用開胸結(jié)扎左冠狀動脈制造MI大鼠模型,術(shù)后次日分別予以等容積生理鹽水及纈沙坦(30 mg/kg/day)灌胃。繼續(xù)喂養(yǎng)至8周,所有存活大鼠均行血流動力學(xué)檢查,并接受活體程序電刺激試驗以誘發(fā)VAs。每組各選取10只大鼠處死后立即取梗死灶周、非梗死左室游離壁(left ventricle free wall,LVFW),利用免疫組織化學(xué)、Westernblot及透射電鏡等方法觀察Cx43的分布及數(shù)量；剩余各組大鼠行心室肌細(xì)胞分離,利用膜片鉗技術(shù)記錄心室肌細(xì)胞瞬時外向鉀電流(transient outward potassium current,Ito)電流密度并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,以評價縫隙連接通道的功能。結(jié)果：1.MI組大鼠VAs誘發(fā)率較Sham組顯著增加(P0.01)；射血分?jǐn)?shù)(ejectionfraction,EF)和心輸出量(cardiac output, CO)較Sham組顯著下降(P0.05), 左室收縮壓(left ventricular systolic pressure,LVSP)和左室內(nèi)壓最大上升／下降速率(±dp/dtmax)亦顯著降低(P0.05)；免疫組織化學(xué)顯示與Sham組相應(yīng)部位相比,梗死灶周心肌組織Cx43分布不均一,含量降低(0.215±0.017,0.330±0.024,P0.05),心室肌細(xì)胞Ito電流密度下降。2.與MI組相比,ARB組VAs誘發(fā)率顯著下降(P0.01)；EF和CO顯著升高,±dp/dtmax亦顯著上升(P0.05),而左心室舒張末壓力(left ventricleend-diastolic pressure,LVEDP)、LVSP下降(P0.05)；梗死灶周心室Cx43含量增加(0.330±0.024,P0.05)、分布不均一的程度減輕,Ito電流密度部分恢復(fù)。3.在LVFW,三組Cx43分布方式相對正常,但MI組Cx43含量與Sham組和ARB組相比顯著下降(P0.05),而在Sham組和ARB組之間未發(fā)現(xiàn)顯著差異。4.Western blot結(jié)果同上述；同時,電鏡檢查發(fā)現(xiàn),ARB纈沙坦干預(yù)可在一定程度上恢復(fù)心肌梗死后異常的Cx43分布。結(jié)論：1.MI后縫隙連接表現(xiàn)出數(shù)量的減少,空間分布的異常及功能的改變等,即縫隙連接重構(gòu),使心肌組織電傳導(dǎo)的一致性喪失,其是導(dǎo)致MI后VAs發(fā)生的機(jī)制之一；2.MI后ARB纈沙坦干預(yù)能有效改善MI所致的縫隙連接重構(gòu),部分恢復(fù)下降的Ito電流密度,從而降低MI后VAs的易感性和發(fā)生率。第二部分阿托伐他汀對心肌梗死后室性心律失常的影響及機(jī)制的實(shí)驗研究目的：探討MI后巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化與交感神經(jīng)重構(gòu)的關(guān)系,明確他汀類藥物阿托伐他汀干預(yù)對MI后巨噬細(xì)胞表型的影響及與MI后交感神經(jīng)重構(gòu)的關(guān)系,為MI后由交感神經(jīng)重構(gòu)引發(fā)的惡性心律失常的防治提供新的靶點(diǎn),并為他汀類藥物在臨床的拓展應(yīng)用提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)實(shí)驗支持。方法：Wistar大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(Sham組),心肌梗死組(MI組),他汀類代表藥物阿托伐他汀干預(yù)心肌梗死組(Statin組)。開胸行左冠狀動脈結(jié)扎制造大鼠MI模型,術(shù)后當(dāng)日分別給以等容積PBS溶液及阿托伐他汀(10mg/kg/day)灌胃。7天后,所有成活動物行程序性電刺激誘發(fā)VAs。分離大鼠腹腔巨噬細(xì)胞分別給以脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)+干擾素γ(interferionγ,IFN-γ)和白介素4(interleukin-4,IL-4)誘導(dǎo)細(xì)胞極化,選組1孔板LPS+IFN-γ誘導(dǎo)刺激的巨噬細(xì)胞給以阿托伐他汀干預(yù),并利用流式細(xì)胞儀檢測巨噬細(xì)胞極性,實(shí)時定量RT-PCR檢測M1型巨噬細(xì)胞分泌的誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、M2型巨噬細(xì)胞分泌的精氨酸酶1(arginasel,Arg1)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-a,TNF-a)口白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)相應(yīng)mRNA的表達(dá)；利用免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色的方法觀察MI后梗死灶周巨噬細(xì)胞浸潤情況及生長相關(guān)蛋白43(growth associated protein 43,GAP43)口酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)陽性神經(jīng)纖維的密度與分布；Western blot檢測心肌組織中NGF蛋白表達(dá)；實(shí)時定量RT-PCR檢測心肌中NGF相應(yīng)mRNA的表達(dá)；ELISA檢測血清中NGF濃度。結(jié)果：1.對于分離的腹腔巨噬細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測提示LPS+IFN-γ和IL-4分別成功誘導(dǎo)刺激巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化；LPS+IFN-γ誘導(dǎo)刺激的細(xì)胞給以阿托伐他汀干預(yù)后,CD86/CD68雙染陽性表達(dá)率(CD86為M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物,CD68巨噬細(xì)胞為標(biāo)記物)顯著下降,提示阿托伐他汀確實(shí)可促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化。2.對于分離的腹腔巨噬細(xì)胞,L PS+IFN-γIL-4誘導(dǎo)刺激組iNOS和Arg1水平與對照組比較顯著不同(P0.01),提示巨噬細(xì)胞極性誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化成功。與對照組相比,LPS+IFN-y誘導(dǎo)刺激組IL-1β、TNF-α相應(yīng)mRNA表達(dá)和IL-4誘導(dǎo)刺激組IL-1β、TNF-α相應(yīng)mRNA表達(dá)顯著升高(P0.01)；但I(xiàn)L-4誘導(dǎo)刺激組二者表達(dá)水平低于LPS+IFN-y誘導(dǎo)刺激組。LPS+IFN-y誘導(dǎo)刺激的細(xì)胞給予阿托伐他汀干預(yù)后可明顯升高Arg 1表達(dá)；并逆轉(zhuǎn)IL-1β、TNF-α目應(yīng)mRNA的升高趨勢(P0.01),提示阿托伐他汀干預(yù)后成功誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化。3.巨噬細(xì)胞浸潤：MI組梗死灶周存在大量CD68陽性巨噬細(xì)胞,且數(shù)量顯著高于Sham組(P0.01); CD163/CD68雙染來標(biāo)記M2型巨噬細(xì)胞(CD163為M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物),其在MI后第3天可計數(shù)到；與MI組相比,Statin組梗死灶周CD163陽性細(xì)胞計數(shù)顯著增加(P0.01),證實(shí)在MI后早期給以阿托伐他汀干預(yù)可促進(jìn)巨噬細(xì)胞表型從M1型向M2型的轉(zhuǎn)化。4.NGF蛋白及1nRNA表達(dá)：與S ham相比,MI組NGF表達(dá)明顯上調(diào)；給以阿托伐他汀干預(yù)后,NGF表達(dá)明顯下調(diào)。同時,NGF陽性的巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯下降。5.神經(jīng)支配：(1)GAP43陽性神經(jīng)纖維：Sham組幾乎不可見；與Sham組相比,MI組梗死灶周神經(jīng)纖維密度顯著增加；與MI組相比,Statin組神經(jīng)密度顯著降低；(2)TH陽性神經(jīng)纖維：S ham組可見其與心肌纖維一致的走形,分布均勻；與Sham組相比,MI組梗死灶周神經(jīng)密度顯著增加,且形態(tài)異常、空間分布混亂；與MI組對比,Statin組神經(jīng)密度顯著降低,生長形態(tài)及空間分布接近于正�；�。結(jié)論：1.MI后巨噬細(xì)胞極性轉(zhuǎn)化可影響NGF的表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)交感神經(jīng)重構(gòu)。2.阿托伐他汀通過促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,下調(diào)NGF表達(dá)。3.MI后早期阿托伐他汀的應(yīng)用可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化,改善交感神經(jīng)重構(gòu),從而發(fā)揮其抗心律失常作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R542.22;R541.7
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本文編號：2303854
