【摘要】：心臟正常節(jié)律的沖動起源于竇房結(jié)。竇房結(jié)區(qū)域在心臟中是一個特化的結(jié)構(gòu),其內(nèi)包含的少于1萬個起搏細胞負責(zé)整個心臟節(jié)律的產(chǎn)生。當(dāng)竇房結(jié)起搏功能衰竭時,數(shù)以億計的工作肌細胞會出現(xiàn)功能障礙導(dǎo)致緩慢型心律失常,嚴(yán)重時會危及生命。作為緩慢型心律失常的新型治療方法,生物起搏旨在修復(fù)心臟傳導(dǎo)系統(tǒng),以恢復(fù)心臟的起搏和傳導(dǎo)功能。過表達轉(zhuǎn)錄因子實現(xiàn)生物起搏是最近研究的熱點。轉(zhuǎn)錄因子ISL-1是竇房結(jié)發(fā)育過程中重要的上游調(diào)控因子,在竇房結(jié)起搏功能的維持中扮演關(guān)鍵的角色。本研究旨在驗證轉(zhuǎn)錄因子ISL-1在成年小鼠心臟中的表達并探索轉(zhuǎn)錄因子ISL-1能否誘導(dǎo)心室工作肌細胞向起搏樣細胞轉(zhuǎn)變,進而實現(xiàn)生物起搏。本研究包含三個實驗：第一部分確定成年小鼠竇房結(jié)區(qū)域并對分離得到的起搏細胞進行細胞形態(tài)及電生理特性檢查；第二部分通過熒光定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡及組織切片免疫熒光等實驗方法,確定轉(zhuǎn)錄因子ISL-1在成年小鼠包括竇房結(jié)區(qū)域在內(nèi)的心臟各部位的表達情況；第三部分構(gòu)建ISL-1基因過表達腺病毒,并利用ISL-1腺病毒作為載體,在體外培養(yǎng)的新生大鼠心室肌細胞及成年小鼠心室內(nèi)過表達ISL-1,以驗證ISL-1能否誘導(dǎo)心室工作肌細胞出現(xiàn)起搏樣細胞特征。首先,第一部分實驗確定了小鼠竇房結(jié)區(qū)域位于上下腔靜脈與右心房交匯處,并驗證了分離得到的竇房結(jié)細胞具備自發(fā)搏動并記錄到If電流,具有典型的起搏細胞形態(tài)及電生理特征,為后續(xù)實驗提供了陽性對照；在第二部分的實驗中,轉(zhuǎn)錄因子ISL-1的表達情況得以確定,熒光定量實時PCR結(jié)果顯示ISL-1主要在成年小鼠的竇房結(jié)區(qū)域表達,而在成年小鼠的心室肌細胞中表達較低(僅為竇房結(jié)組織的約1/330)；應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡方法顯示轉(zhuǎn)錄因子ISL-1高表達于成年小鼠的竇房結(jié)區(qū)域,而在成年小鼠的心房及心室組織幾乎不表達；利用免疫熒光可以直接觀察ISL-1的表達及分布情況,ISL-1在竇房結(jié)區(qū)域熒光信號最強,而且聚集在細胞核內(nèi),而在心室組織中未能檢測到ISL-1的信號。上述三種方法均證實了轉(zhuǎn)錄因子ISL-1高表達于成年小鼠的竇房結(jié)區(qū)域,而在成年小鼠的心室肌細胞內(nèi)幾乎不表達。最后利用構(gòu)建的腺病毒作為載體,在體外培養(yǎng)的新生大鼠心室肌細胞中過表達了ISL-1后,細胞形態(tài)發(fā)生類竇房結(jié)細胞樣變化。同時,細胞的自律性顯著提高。同樣通過在成年小鼠心室內(nèi)注射腺病毒使其過表達轉(zhuǎn)錄因子ISL-1,可以誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)頻發(fā)室性早搏。通過給予異丙腎上腺素刺激,ISL-1過表達小鼠出現(xiàn)房室分離,室性節(jié)律快于竇性心律。進一步研究發(fā)現(xiàn),ISL-1過表達誘導(dǎo)的心室自律性的提高與心室肌細胞表達譜向起搏樣細胞轉(zhuǎn)化相關(guān),多種參與竇房結(jié)細胞起搏的離子通道及相關(guān)基因的表達發(fā)生變化。綜上所述,本研究驗證了轉(zhuǎn)錄因子ISL-1表達集中于成年小鼠竇房結(jié)區(qū)域,過表達轉(zhuǎn)錄因子ISL-1可以誘導(dǎo)成熟心室肌細胞轉(zhuǎn)化為起搏樣細胞,為利用轉(zhuǎn)錄因子ISL-1作為生物起搏誘導(dǎo)因子提供了可能,具有潛在的臨床應(yīng)用價值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R54

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本文編號：2303077