【摘要】：胸主動脈瘤是心臟外科十分兇險的大血管疾病,具體潛伏性強,預(yù)后差,術(shù)后并發(fā)癥多等特點。近年來,胸主動脈瘤的發(fā)病率成逐年遞增趨勢。目前研究表明,諸多因素參與了胸主動脈瘤的發(fā)生,如吸煙,高血壓,年齡、家族遺傳史、動脈粥樣硬化等。胸主動脈瘤在發(fā)病早期無特異性癥狀,僅在瘤體持續(xù)擴大壓迫周圍器官或組織時,表現(xiàn)出如嗆咳,呼吸困難,吞咽困難等非特異性癥狀。胸主動脈瘤的治療手段較為單一,以主動脈置換術(shù)或血管腔內(nèi)支架植入術(shù)為主,但手術(shù)難度較大,手術(shù)并發(fā)癥多,預(yù)后較差。因此,探索胸主動脈瘤的發(fā)生發(fā)展的分子機制,并以此作為治療靶點將為主動脈瘤前期治療提供新的依據(jù)。主動脈血管壁分為內(nèi)膜、中膜、外膜三層,其中中膜是主動脈壁最重要的部分。主動脈壁中膜主要由血管平滑肌細胞(Vascular Smooth Muscle Cell , VSMC)、膠原蛋白(Collagen)、彈力纖維(Elastin),及多種細胞外基質(zhì)成分,炎性因子等構(gòu)成,上述成分發(fā)生病理變化時,均可能導(dǎo)致血管壁收縮功能及強度下降,在主動脈高速高壓血流沖擊下,出現(xiàn)血管壁擴張等變化,最終導(dǎo)致胸主動脈瘤的發(fā)生。目前研究較多的分子機制包括;1、VSMCs由收縮型向分泌型轉(zhuǎn)化,從而影響其原有的收縮功能,影響血管壁強度;2、血管壁中膠原及彈力纖維組成成分及分布異常,導(dǎo)致血管壁脆性升高,彈性下降;3、外界因素刺激下,VSMCs或炎性細胞等分泌和激活基質(zhì)金屬蛋白酶2、9 (matrixmetalloproteinase2/9,MMP2/9)等,破壞膠原等,導(dǎo)致血管壁成分破壞;4、TGFβ/SMAD通路異常近年來被認為是主動脈瘤發(fā)生的重要因素。任何因素參與或影響了上述過程均可能導(dǎo)致了主動脈瘤的發(fā)生發(fā)展。miRNA是一類在真核生物中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA,長度約為20-25個核苷酸,其主要作用機制包括:與mRNA上相關(guān)堿基結(jié)合,抑制mRNA轉(zhuǎn)錄后翻譯;通過CAP或Poly (A)依賴的途徑抑制mRNA的翻譯;影響mRNA脫腺苷化。前體miRNA在Exprotin-5復(fù)合物的作用下轉(zhuǎn)運出胞核,在胞漿中有Dicer剪切成為成熟miRNA,并進一步形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex, RISC),與 mRNA 的 3'-UTR 區(qū)域結(jié)合發(fā)揮作用,當miRNA與相關(guān)靶點完全互補時,甚至可以引起mRNA的降解。目前亦有研究表明,miRNA影響基因啟動子的CpG島甲基化作用,在轉(zhuǎn)錄水平直接對靶基因進行調(diào)控作用。諸多研究表明miRNA可能參與了主動脈瘤的發(fā)生發(fā)展。Kim等研究表明miR-712能夠靶向抑制TIMP3及RECK表達,進而在體內(nèi)體外實驗中打破基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑的平衡,促進主動脈瘤模型小鼠血管壁的擴張。Cheng及Cordes等研究表明抑制miR-143/145能夠顯著一直SMC中α-SMA,Calponin及SM-MHC的表達,進而參與了主動脈瘤的發(fā)生發(fā)展。亦有研究表明,在SMC中過表達miR-21能夠促進SMC增殖,抑制其凋亡。Maegdefessel等亦通過動物實驗表明,在動物體內(nèi)過表達miR-24能夠抑制主動脈瘤的擴張。綜上所述,多種miRNA可通過多不同途徑參與主動脈瘤的發(fā)生,然而探索一種新的且十分有效的miRNA作為主動脈瘤的干預(yù)靶點仍是十分必要的。在本課題研究中,我們擬解決以下幾個問題:(1)篩選TGFβ/SMAD信號通路上重要的miRNA,在胸主動脈瘤血管壁中檢測表達及定位情況;(2)通過體外實驗探索該miRNA對VSMCs生物學活性的影響;(3)探索該miRNA新的下游靶基因,并驗證其功能;(4)通過構(gòu)建主動脈特異性過表達miRNA的轉(zhuǎn)基因小鼠,在體內(nèi)觀察該miRNA對主動脈瘤發(fā)生的影響。下文將就該四部分展開討論。第一部分胸主動脈瘤中差異表達miRNA的篩選目的篩選在胸主動脈瘤中血管壁中具有顯著表達差異的miRNA方法通過生物信息學分析,找出多個在TGFβ/SMAD信號通路上有重要作用的miRNA作為備選的待檢測miRNA。利用TGFβ處理人血管平滑肌細胞(human vascular smooth muscle cell,h-VSMCs),并在其中檢測相關(guān) miRNA 的表達情況,篩選出表達差異最為顯著的miRNA。以主動脈擴張1.5倍為主動脈瘤診斷標準,收集在長海醫(yī)院心血管外科行胸主動脈瘤手術(shù)的患者的血管壁標本,其中排除家族遺傳病或自身免疫病導(dǎo)致的動脈瘤、梅毒性動脈瘤、外傷性動脈瘤等。取心臟移植或主動脈瓣置換等患者主動脈壁作為正常對照組。在取得的標本中通過熒光定量PCR檢測上述篩選出的miRNA,通過原位雜交在標本中檢測該miRNA定位情況。結(jié)果RT-PCR結(jié)果提示在TGFβ通路相關(guān)的miRNA中,miR-494在TGFβ處理的h-VSMCs表達差異最為顯著;在對組織標本的檢測中,miR-494在胸主動脈瘤患者血管壁中表達顯著下降,原位雜交提示miR-494主要定位于血管壁中層血管平滑肌細胞中。結(jié)論miR-494在胸主動脈瘤患者血管壁中表達水平低于正常組,且主要定位于血管壁中層。第二部分miR-494對血管平滑肌細胞生物學功能的影響目的探索miR-494對主動脈血管平滑肌細胞生物學功能的影響。方法培養(yǎng)原代h-VSMCs,待細胞性狀及表型穩(wěn)定后轉(zhuǎn)至6孔板中,待細胞密度達70%,采用TGFβ (10ng/ml)處理h-VSMCs,于不同時間點檢測miR-494表達,觀察miR-494動態(tài)變化情況;同時檢測表型轉(zhuǎn)化相關(guān)基因隨著時間點變化情況。同樣方法培養(yǎng)h-VSMCs,待細胞密度達70%后采用Lipo2000轉(zhuǎn)染miR-494-mimic,檢測表型轉(zhuǎn)化相關(guān)標志物(SM22, MYH11)等表達變化情況;Cck-8檢測h-VSMCs增殖情況;劃痕試驗檢測h-VSMCs遷移情況;ELISA檢測h-VSMCs分泌功能改變。結(jié)果TGFβ能顯著提高h-VSMCs中miR-494水平,且隨時間點呈逐漸增強趨勢;TGFβ能夠促進收縮型相關(guān)基因表達,于刺激后72h達到表達高峰后開始下降。在TGFβ處理48h時通過轉(zhuǎn)染miR-494-mimic提高h-VSMCs中miR-494水平能夠促進抑制收縮型相關(guān)蛋白(SM22,MYH11)的表達,而在TGFβ處理72h后通過miR-494-inhibitor下調(diào)h-VSMCs中miR-494 水平,能夠促進收縮型相關(guān)蛋白的表達。在h-VSMCs中過表達miR-494顯著能夠抑制收縮型相關(guān)蛋白的表達,促進h-VSMCs增殖和遷移;能夠促進Collagen的表達,對Elastin表達無顯著影響,能夠顯著抑制MMP2的分泌。結(jié)論TGFβ能夠顯著促進miR-494表達,當miR-494達到一定水平后,能夠負反饋抑制TGFβ的作用;miR-494能夠誘導(dǎo)h-VSMCs由合成型向收縮型轉(zhuǎn)化;miR-494能夠顯著抑制MMP2的分泌。第三部分miR-494調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞生物學功能的分子機制目的探索并確定miR-494的靶基因及靶基因的功能,探索miR-494抑制MMP2分泌的機制。方法通過多個數(shù)據(jù)庫查詢并整合miR-494潛在靶基因,進一步通過GO分析初步篩選miR-494可能的靶基因。構(gòu)建熒光素酶報告基因質(zhì)粒,通過螢光素酶報告實驗確定miR-494的直接靶基因。通過Western Blot檢測在h-VSMCs中過表達miR-494后靶基因的表達水平,通過拯救試驗(Rescue試驗)進一步驗證靶基因及其功能。通過Western Blot檢測miR-494可能抑制共結(jié)合蛋白聚糖-1 (Syndecan-1,SDC-1)表達,進而抑制了 MMP2的水平,并通過拯救實驗明確了 SDC-1在miR-494抑制MMP2表達中的作用。結(jié)果通過多個數(shù)據(jù)篩選及GO分析,初步篩選了活化T細胞核因子5 (The Nuclear factor of activated T-cells 5,NFAT5)為 miR-494 的直接靶基因,進一步熒光素酶報告基因?qū)嶒灤_定了 NFAT5與miR-494直接結(jié)合。進一步在h-VSMCs中過表達miR-494能夠顯著抑制NFAT5的表達水平。拯救試驗證明miR-494可通過抑制NFAT5促進h-VSMCs的表型轉(zhuǎn)化、增殖及遷移,過表達NFAT5能夠逆轉(zhuǎn)這一過程。過表達miR-494能夠顯著抑制h-VSMCs中SDC-1及MMP2的表達,而在過表達miR-494的同時提高SDC-1的水平,能夠緩解miR-494對MMP2的抑制作用。結(jié)論miR-494可通過直接抑制NFAT5促進h-VSMCs表型轉(zhuǎn)化、增殖及遷移。另一方面,miR-494通過SDC-1抑制MMP2的合成。第四部分體內(nèi)實驗探索miR-494對胸主動脈瘤發(fā)生發(fā)展的影響目的通過體內(nèi)實驗探索miR-494對主動脈瘤發(fā)生發(fā)展的影響。方法采用Apoe-/-小鼠配合人血管緊張素Ⅰ(AngiotensinⅡ,Ang Ⅱ)構(gòu)建小鼠主動脈瘤模型,皮下注射miR-494抑制物miR-494-Antagomir后,通過小鼠主動脈超聲檢測主動脈瘤形成情況。通過HE染色和VB染色觀察小鼠血管壁病理改變情況。構(gòu)建主動脈血管壁特異性miR-494過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠,并利用該小鼠構(gòu)建主動脈瘤,通過上述方法檢測主動脈瘤形成情況及病理改變情況。通過ELISA檢測、免疫組織化學染色及原位明膠酶譜法探索miR-494影響主動脈瘤發(fā)生發(fā)展的機制。結(jié)果Apoe--小鼠聯(lián)合Ang Ⅱ能夠有效構(gòu)建主動脈瘤模型,miR-494-Antagomir注射組相對于模型組,主動脈內(nèi)徑擴張更明顯,VB染色提示miR-494-Antagomir注射組血管壁中彈力纖維及膠原破壞亦更嚴重。miR-494轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建的主動脈瘤模型中,主動脈瘤擴張顯著改善。VB染色提示轉(zhuǎn)基因小鼠血管壁彈力纖維及膠原的破壞程度相較于野生型小鼠有所改善。ELISA檢測結(jié)果提示miR-494過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠血漿中MMP2水平顯著低于野生型小鼠,免疫組化亦證明過表達miR-494能夠顯著抑制小鼠血管壁中MMP2的表達,原位明膠酶譜結(jié)果提示miR-494能夠抑制血管壁中MMPs的活性。結(jié)論體內(nèi)試驗表明過表達miR-494能夠有效緩解模型小鼠主動脈瘤的發(fā)生發(fā)展,這種對血管的保護作用主要通過miR-494抑制MMPs的合成、分泌及活性實現(xiàn)。
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【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R543.1

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本文編號：2302430