【摘要】：高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia,HHcy)是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,中等程度的血清同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平升高即可增加罹患心衰的風(fēng)險(xiǎn)。受飲食習(xí)慣的影響,我國人群Hcy水平普遍高于西方國家,其中以輕中度HHcy在臨床上較為常見。目前,由于人們并未足夠重視HHcy對心血管的危害作用,導(dǎo)致血清Hcy水平未能得到及時(shí)有效干預(yù),使心血管受到不可逆的損傷,促進(jìn)了心血管不良事件的發(fā)生。雖然升高的Hcy水平可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞損傷,促進(jìn)血栓形成,導(dǎo)致動(dòng)脈血栓事件發(fā)生已被廣泛證實(shí),但是升高的Hcy水平對心肌細(xì)胞影響如何目前研究尚不充分。我們前期研究表明,輕中度HHcy可促進(jìn)高血壓對心臟的損害,加重高血壓患者的左室重構(gòu),導(dǎo)致高血壓患者心功能明顯降低。然而,HHcy單獨(dú)存在能否對心肌細(xì)胞造成損傷,從而影響心臟結(jié)構(gòu)與功能,以及其分子生物學(xué)機(jī)制如何目前尚不可知。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)過度激活可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,該機(jī)制是多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)。缺血缺氧、高血壓及高糖血癥等都可激活心肌細(xì)胞ERS,過度或持久的ERS可誘導(dǎo)促凋亡因子的表達(dá),調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡,從而影響心臟結(jié)構(gòu)及功能。我們前期研究表明,HHcy可加重高血壓誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ERS,引起促凋亡因子caspase-12及C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)表達(dá)明顯上調(diào),激活了促凋亡信號(hào)通路,可能調(diào)控了心肌細(xì)胞凋亡,因此促進(jìn)了高血壓大鼠心肌重構(gòu)。然而,HHcy單獨(dú)作用于心臟時(shí)是否能激活心肌細(xì)胞ERS,以及激活的ERS是否直接了調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡目前尚不清楚。線粒體是心肌細(xì)胞另一重要的細(xì)胞器,除了產(chǎn)生維持細(xì)胞存活的ATP和調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝之外,還在細(xì)胞凋亡和壞死過程中起關(guān)鍵作用。線粒體不僅參于了內(nèi)部凋亡途徑的觸發(fā),也參于了外部凋亡途徑的放大。然而,Hcy是否引起心肌細(xì)胞線粒體功能障礙,并促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡事件的發(fā)生目前尚不清楚。目前研究表明,線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)間有密切的聯(lián)系,ERS可影響線粒體功能,因此有學(xué)者提出了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體軸的概念。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是心肌細(xì)胞Ca2+存儲(chǔ)重要場所,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔Ca2+的紊亂是激活ERS的關(guān)鍵因素;過度的ERS可導(dǎo)致Ca2+由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)引起胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度增加,而胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度增加恰好是誘導(dǎo)線粒體應(yīng)激導(dǎo)致線粒體功能障礙的重要原因。這可能是ERS與線粒體功能障礙間信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制之一,是否存在其它信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制目前尚在探索中。在HHcy環(huán)境下,心肌細(xì)胞是否存在線粒體功能障礙,以及其與ERS間存在何種關(guān)系目前尚不可知。�；撬崤cHcy同是含硫氨基酸,兩者有相同的生成途徑,卻對心血管發(fā)揮截然相反的作用。�；撬嵩谌梭w內(nèi)含量豐富,其中心臟中�；撬岷考s占體內(nèi)�；撬峥偭康�75%。研究表明,�；撬釋π难芷鸨Ｗo(hù)作用,適量的牛磺酸補(bǔ)充可發(fā)揮降壓、降脂及降糖的功效。牛磺酸已經(jīng)被用于臨床治療心功能衰竭患者,據(jù)報(bào)道補(bǔ)充�；撬峥墒寡蟮攸S或者利尿劑不敏感的心衰患者獲益。牛磺酸可通過有效清除氧自由基、維持細(xì)胞Ca2+穩(wěn)態(tài)及確保蛋白正確折疊發(fā)揮其保護(hù)功能。目前較多研究報(bào)道了牛磺酸可抑制腦細(xì)胞的ERS,改善線粒體功能障礙,治療腦功能相關(guān)疾病。然而,在HHcy環(huán)境下,�；撬崾欠衲鼙Ｗo(hù)心肌細(xì)胞線粒體功能及抑制心肌細(xì)胞ERS,從而改善心臟結(jié)構(gòu)及功能,目前尚不明確。鑒于上述情況,本課題擬在已有文獻(xiàn)報(bào)道及前期工作的基礎(chǔ)上,首先通過建立HHcy大鼠模型觀察HHcy是否損害大鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能,并探討ERS和線粒體應(yīng)激在此過程中所起的作用;觀察牛磺酸干預(yù)對HHcy大鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能的保護(hù)作用,并研究其保護(hù)心肌細(xì)胞的相關(guān)分子機(jī)制。其次,通過體外研究觀察Hcy對H9C2心肌細(xì)胞ERS的影響,探討其是否直接調(diào)控了細(xì)胞凋亡;觀察Hcy對H9C2心肌細(xì)胞線粒體功能的影響,探討其是否促進(jìn)了細(xì)胞凋亡事件的發(fā)生,以及初步探討其與ERS之間潛在信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制;通過觀察�；撬釋9C2心肌細(xì)胞ERS及線粒體應(yīng)激的干預(yù)作用,探討牛磺酸對抗Hcy心肌細(xì)胞毒性作用的分子機(jī)制。第一部分 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)HHcy誘導(dǎo)大鼠心肌結(jié)構(gòu)及功能變化的分子機(jī)制及�；撬岣深A(yù)的研究目的:研究HHcy對大鼠心肌結(jié)構(gòu)及功能的影響,以及探討ERS和線粒體應(yīng)激在此過程中所起作用;研究HHcy環(huán)境下,牛磺酸對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及保護(hù)機(jī)制。方法:將30只Wistar大鼠隨機(jī)分為三組,分別為對照組:普通顆粒飼料喂養(yǎng)及飲用自來水;高蛋氨酸組:含3%蛋氨酸顆粒料喂養(yǎng)及飲用自來水;�；撬峤M:含3%蛋氨酸顆粒料喂養(yǎng)及飲用含牛磺酸2%w/v的自來水。各組大鼠飼養(yǎng)第20周末,分別采用無創(chuàng)鼠尾動(dòng)脈血壓儀檢測大鼠心率及SBP;便攜式Hcy檢測儀檢測血清Hcy水平;小動(dòng)物超聲檢測大鼠心臟功能;頸動(dòng)脈插管檢測心臟血流動(dòng)力;免疫組化檢測GRP78、CRT、Bcl-2及Bax在心肌中表達(dá);Western blot檢測TUAT、GRP78、CRT、caspase-12、CHOP、Bcl-2、Bax、caspase-3及Cyt c在心肌中蛋白表達(dá)水平;柱前衍生化反相高效液相色譜法測定心肌組織�；撬岷�;TUNEL檢測心肌細(xì)胞凋亡情況;掃描電鏡觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果:(1)高蛋氨酸組大鼠血清Hcy水平為48.76±8.33μmol/L顯著高于對照組8.12±3.45μmol/L(p0.01),�；撬峤M血清Hcy水平為34.58±5.04μmol/L低于高蛋氨酸組(p0.05)。(2)高蛋氨酸組大鼠心臟功能指標(biāo)LVEF及LVFS明顯低于對照組(p0.05),牛磺酸組LVEF及LVFS明顯高于高蛋氨酸組(p0.05)。(3)高蛋氨酸組大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)LVSP及±dp/dtmax明顯低于對照組(p0.05),LVEDP顯著高于對照組(p0.01);�；撬峤MLVSP及±dp/dtmax明顯高于高蛋氨酸組(p0.05),LVEDP明顯低于高蛋氨酸組(p0.05)。(4)免疫組化檢測結(jié)果顯示,高蛋氨酸組大鼠心肌組織GRP78及CRT表達(dá)顯著高于對照組(p0.01),牛磺酸組明顯低于高蛋氨酸組(p0.05);高蛋氨酸組Bcl-2及Bax表達(dá)顯著高于對照組(p0.01),�；撬峤MBcl-2及Bax表達(dá)分別明顯低于高蛋氨酸組(p0.05,p0.01)。(5)Western blot檢測結(jié)果顯示,高蛋氨酸組大鼠心肌組織GRP78、CRT蛋白表達(dá)水平均明顯高于對照組(p0.05),TAUT、CHOP、cleaved caspase-12、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3及胞質(zhì)內(nèi)Cyt c均顯著高于對照組(p0.01);牛磺酸組TAUT、GRP78、CRT、CHOP、cleaved caspase-12、Bcl-2、Bax及cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平均明顯低于高蛋氨酸組(p0.05),胞質(zhì)內(nèi)Cyt c蛋白表達(dá)水平顯著低于高蛋氨酸組(p0.01)。(6)高蛋氨酸組大鼠心肌組織�；撬岷匡@著低于對照組(p0.01),牛磺酸組心肌組織�；撬岷棵黠@高于高蛋氨酸組(p0.05)。(7)對照組未見TUNEL陽性染色心肌細(xì)胞核;高蛋氨酸組TUNEL陽性染色心肌細(xì)胞核數(shù)量較多;牛磺酸組TUNEL陽性染色心肌細(xì)胞核數(shù)量較少。(8)對照組大鼠心肌纖維排列整齊,線粒體形態(tài)規(guī)則;高蛋氨酸組心肌纖維排列紊亂,線粒體腫脹甚至有融合現(xiàn)象;�；撬峤M心肌纖維排列較整齊,線粒體腫脹甚至有融合現(xiàn)象明顯改善。結(jié)論:HHcy可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡,損害大鼠心肌結(jié)構(gòu)及降低心臟功能,其潛在分子機(jī)制可能與ERS及線粒體應(yīng)激激活有關(guān);牛磺酸可抑制HHcy誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡,改善大鼠心肌結(jié)構(gòu)與功能,其保護(hù)機(jī)制可能與緩解ERS及線粒體應(yīng)激有關(guān)。第二部分細(xì)胞實(shí)驗(yàn)Hcy誘導(dǎo)ERS及線粒體應(yīng)激調(diào)控H9C2心肌細(xì)胞凋亡及�；撬岣深A(yù)研究目的:研究Hcy對H9C2心肌細(xì)胞ERS及線粒體應(yīng)激的影響,探討ERS激活、線粒體應(yīng)激及心肌細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系;研究牛酸酸對Hcy誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞保護(hù)作用及保護(hù)機(jī)制。方法:使用Hcy處理H9C2心肌細(xì)胞,觀察心肌細(xì)胞ERS相關(guān)蛋白表達(dá)的變化及線粒體應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)變化;使用2 m M Hcy處理H9C2心肌細(xì)胞,觀察細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化;使用4-苯基丁酸(4-PBA)阻斷ERS,觀察心肌細(xì)胞凋亡率變化;使用salubrinal及si-PERK阻斷PERK信號(hào)通路,觀察線粒體應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)、心肌細(xì)胞活力及凋亡率變化;使用牛磺酸預(yù)處理,觀察心肌細(xì)胞ERS相關(guān)蛋白表達(dá)的變化及線粒體應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)變化。分別使用CCK-8檢測細(xì)胞活力;使用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡率;使用Fluo-4,AM Ca2+熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化;使用JC-1檢測細(xì)胞線粒體膜電位變化;使用紅色線粒體內(nèi)ROS探針檢測線粒體內(nèi)ROS水平;使用綠色胞質(zhì)內(nèi)ROS探針檢測胞質(zhì)內(nèi)ROS水平變化;使用Western blot方法檢測蛋白表達(dá)水平變化,使用掃描電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果:(1)與對照組比較,Hcy 1.0-4.0 m M可顯著降低心肌細(xì)胞活力,使心肌細(xì)胞活力從70.97%降低至47.54%(p0.01);與對照組相比,1.0、2.0及3.0 m M處理可分別導(dǎo)致13.7%心肌細(xì)胞凋亡(p0.05)、16.7%心肌細(xì)胞凋亡(p0.01)及20.1%心肌細(xì)胞凋亡(p0.01)。與對照組比較,Hcy 1.0 m M干預(yù)12 h時(shí)H9C2心肌細(xì)胞活力明顯下降(p0.05),干預(yù)24 h及36 h可導(dǎo)致心肌細(xì)胞活力從81.93%降低至54.55%(p0.01)。(2)2.0 m M Hcy處理H9C2心肌細(xì)胞5 min,可使細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度持續(xù)增強(qiáng)且出現(xiàn)脈沖現(xiàn)象,單個(gè)細(xì)胞Ca2+熒光區(qū)域不斷變化。(3)Hcy低濃度及短時(shí)間處理H9C2心肌細(xì)胞可使ERS應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、p-IER1及p-e IF2α蛋白表達(dá)升高,使ERS應(yīng)激相關(guān)蛋白ATF6 p90蛋白表達(dá)降低;Hcy高濃度及長時(shí)間處理H9C2心肌細(xì)胞可使ERS應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、p-IER1及p-e IF2α蛋白表達(dá)降低,使ERS應(yīng)激相關(guān)蛋白ATF4、CHOP、p-JNK及cleaved caspase-12蛋白表達(dá)升高(p0.05,p0.01)。(4)Hcy高濃度及長時(shí)間處理可使線粒體應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)細(xì)胞線粒體膜電位逐漸降低及胞質(zhì)內(nèi)Cyt c濃度升高;使cleaved caspase-9及cleaved caspase-3表達(dá)升高(p0.05,p0.01);可使線粒體及胞質(zhì)內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。(5)通過使4-PBA干預(yù)后,Hcy誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞CHOP、cleaved caspase-12及p-JNK蛋白表達(dá)明顯降低(p0.05,p0.01),且使細(xì)胞凋亡率由11.6%降低至7.7%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(6)通過使salubrinal及si-PERK阻斷PERK通路后,Hcy誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡率由15.5%降低至11.7%及由16.5%降低至10.6%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(7)通過使salubrinal阻斷PERK通路后,線粒體應(yīng)激相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比率顯著降低(p0.01),cleaved caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低(p0.05)。(8)�；撬犷A(yù)處理可使Hcy誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞活力顯著升高(p0.01),使細(xì)胞凋亡率顯著降低(p0.01);牛磺酸預(yù)處理可升高Hcy誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞線粒體膜電位,減少細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS產(chǎn)生;Hcy1.0 m M及2.0m M處理可引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體腫脹,甚至導(dǎo)致線粒體融合及胞質(zhì)內(nèi)空泡形成,而�；撬犷A(yù)處理可明顯改善Hcy誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹及線粒體融合現(xiàn)象。結(jié)論:Hcy誘導(dǎo)的ERS直接調(diào)控H9C2心肌細(xì)胞凋亡,其中PERK通路在ERS調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡過程中起重要作用。2、Hcy可誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞線粒體應(yīng)激,引起線粒體功能障礙,導(dǎo)致caspase依賴的級(jí)聯(lián)凋亡反應(yīng)激活,可能促進(jìn)了細(xì)胞凋亡事件的發(fā)生;另外,Ca2+紊亂及PERK通路可能可能是Hcy誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ERS及線粒體應(yīng)激的紐帶。3、�；撬峥捎行ПＷo(hù)Hcy誘導(dǎo)的H9C2大鼠心肌細(xì)胞,其保護(hù)機(jī)制可能與抑制Hcy誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ERS激活及緩解Hcy誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞線粒體功能障礙有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R54
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本文編號(hào)：2292738