【摘要】：肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary arterial hypertension,PAH)是以肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)靜息胞漿游離Ca2+濃度(intracellular free calcium concentration,[Ca2+]i)增高、肺血管增生和重塑為主要特征的一種疾病。近來(lái)研究表明野百合堿(monocrotaline,MCT)致PAH大鼠PAs的鈣池操縱性鈣內(nèi)流(sotre-operated calcium entry,SOCE)增加,在PAH胞漿內(nèi)Ca2+增高起重要的作用。胞漿內(nèi)Ca2+激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin,Ca N,PP2B),后者引起胞漿內(nèi)活化T細(xì)胞核因子(Nuclear Factor of Activated T Cells,NFAT)去磷酸化并轉(zhuǎn)位入核,從而影響細(xì)胞的功能。本研究在MCT誘導(dǎo)PAH大鼠模型基礎(chǔ)上,首先觀察Ca2+-Ca N-NFAT信號(hào)通路在MCT致PAH大鼠發(fā)病過(guò)程中的作用以及MCT致PAH大鼠PASMCs的增殖、遷移和凋亡等功能的變化;在細(xì)胞水平予Ca N抑制劑環(huán)胞素A(cyclosporin A,Cs A)和采用si RNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染沉默NFATc2/3/4的表達(dá),觀察大鼠PASMCs增殖、遷移和凋亡的變化,以進(jìn)一步明確Ca N-NFAT信號(hào)通路信號(hào)分子的作用;在動(dòng)物水平予Cs A或人參皂苷Rb1(ginsenoside Rb1)治療MCT誘導(dǎo)PAH大鼠3W,觀察Cs A或Rb1對(duì)MCT誘發(fā)的大鼠PAH的防治作用并探討可能的機(jī)制,并進(jìn)一步證實(shí)Ca2+-Ca N-NFAT通路在PAH中的作用,以期為PH治療提供新的靶向藥物。第一部分MCT致PAH大鼠PASMCs的Ca2+-Ca N-NFAT信號(hào)通路的變化及增殖、遷移和凋亡的影響目的:觀察Ca2+-Ca N-NFAT信號(hào)通路在MCT致PAH大鼠致病過(guò)程中的作用以及MCT致PAH大鼠PASMCs增殖、遷移和凋亡的變化。方法:SD大鼠予MCT按50 mg/kg劑量一次性腹腔注射飼養(yǎng)3W建立PAH大鼠模型,采用:(1)血流動(dòng)力學(xué)和肺動(dòng)脈形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法,測(cè)定大鼠右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure,RVSP)、平均右心室內(nèi)壓(pulmonary arterial pressure,RVP)、右心重量指數(shù)(right ventricular mass index,RVMI)和肺動(dòng)脈(pulmonary arteries,PAs)形態(tài)的變化;(2)Fluo-3熒光檢測(cè)[Ca2+]i方法,測(cè)定CPA誘導(dǎo)PASMCs胞膜[Ca2+]i升高的作用;(3)熒光定量PCR、Western Blot和免疫熒光等檢測(cè)方法,測(cè)定PAH大鼠PASMCs的Ca N、NFAT m RNA和蛋白表達(dá)的變化;(4)MTS和PCNA法,測(cè)定PASMCs的增殖情況;(5)transwell小室測(cè)定PASMCs的遷移情況;(6)Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)PASMCs的凋亡。結(jié)果:與正常對(duì)照組相比,(1)MCT模型大鼠的RVSP、RVP和RVMI均顯著增高,肺內(nèi)小動(dòng)脈管壁增厚,管腔狹窄,提示成功建立MCT致PAH大鼠模型;(2)經(jīng)CPA誘發(fā)后MCT組的[Ca2+]i升高幅度顯著增高,提示PAH大鼠PASMCs SOCE功能增強(qiáng);(3)MCT致PAH大鼠PASMCs的Ca NBβ-NFATc2/3/4m RNA和蛋白表達(dá)明顯增高,提示PAH上調(diào)Ca NBβ和NFATc2/3/4的表達(dá);(4)MCT致PAH大鼠PASMCs促進(jìn)增殖和遷移、抑制凋亡,推測(cè)可能與PAH大鼠PASMCs NFAT介導(dǎo)的功能增強(qiáng)有關(guān)。結(jié)論:MCT可誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生PAH,其機(jī)制可能是MCT致PAH大鼠PASMCs的SOCE功能增強(qiáng),Ca NBβ-NFATc2/3/4表達(dá)上調(diào),引起NFATc2/3/4介導(dǎo)的PASMCs增殖活性和遷移能力增強(qiáng)、凋亡減少,導(dǎo)致[Ca2+]i增高、血管平滑肌增殖和血管重塑,SOCE功能增強(qiáng)可能是產(chǎn)生PAH的啟動(dòng)因素。第二部分Ca N-NFAT信號(hào)通路對(duì)大鼠PASMCs增殖、遷移和凋亡的作用目的:在細(xì)胞水平觀察Cs A和si NFATc2/3/4對(duì)CON和MCT致PAH大鼠增殖、凋亡和遷移的影響,以進(jìn)一步明確Ca N-NFAT信號(hào)通路信號(hào)分子在MCT致大鼠PAH發(fā)生發(fā)展中的作用。方法:CON組和MCT致PAH模型組的大鼠PASMCs原代培養(yǎng),予15、30和60μMCs A干預(yù),或si RNA轉(zhuǎn)染沉默NFATc2/3/4,對(duì)照組只加Lipofectamine?RNAi MAX轉(zhuǎn)染試劑即MOCK組,si NFATc2/3/4組轉(zhuǎn)染分別針對(duì)大鼠NFATc2/3/4基因的si RNA,采用:(1)熒光定量PCR和免疫熒光檢測(cè)方法,測(cè)定si NFATc2/3/4轉(zhuǎn)染大鼠PASMCs后NFATc2/3/4 m RNA和蛋白表達(dá)水平的變化,以驗(yàn)證干擾效果;(2)MTS法和PCNA法,檢測(cè)Cs A干預(yù)或si NFATc2/3/4干擾后對(duì)大鼠PASMCs的增殖變化;(3)transwell小室測(cè)定Cs A干預(yù)或si NFATc2/3/4轉(zhuǎn)染組對(duì)大鼠PASMCs的遷移情況;(4)Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)PASMCs的凋亡情況。結(jié)果:(1)Cs A對(duì)PASMCs增殖抑制作用的IC50分別為34.73±2.23μmol/L(CON組)和23.29±1.09μmol/L(MCT組);(2)CON組和MCT組,Cs A干預(yù)均呈劑量依賴性(15μM、30μM、60μM)抑制PASMCs的增殖和遷移,且MCT組抑制效應(yīng)較CON組更為顯著。(3)CON組和MCT組,均只在60μM Cs A干預(yù)顯著抑制細(xì)胞凋亡,其抑制效果在CON組更明顯,提示MCT致PAH大鼠PASMCs,Ca N可通過(guò)促進(jìn)增殖和遷移作用、抑制和凋亡參與肺血管重構(gòu)。(4)在CON和MCT組,si NFATc2/3/4轉(zhuǎn)染均顯著降低PASMCs NFATc2/3/4 m RNA和蛋白的表達(dá),提示轉(zhuǎn)染成功;(5)在CON組和MCT組,si NFATc2/4轉(zhuǎn)染組均顯著抑制PASMCs的增殖和遷移、促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,提示PASMCs中,NFATc2/4可促進(jìn)增殖和遷移、抑制凋亡;(6)在CON組,si NFATc3干擾對(duì)CON組PASMCs的增殖、凋亡和遷移沒(méi)有影響,而在MCT組,si NFATc3沉默顯著抑制PASMCs的增殖和遷移、并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,提示NFATc3可能不參與正常大鼠PASMCs的增殖和遷移,但在MCT致PAH大鼠的PASMCs中,NFATc3可能是促進(jìn)細(xì)胞增殖的一個(gè)因素。結(jié)論:Ca N-NFAT信號(hào)通路信號(hào)分子參與PAH的發(fā)病過(guò)程。Ca N參與PAH的PASMCs的增殖活性和遷移能力的增強(qiáng)。NFATc2/4是大鼠PASMCs的生長(zhǎng)和增生所必需的,而NFATc2/3/4可能參與PAH血管平滑肌的增殖和血管重塑,推測(cè)NFATc3對(duì)PAH的PASMCs的增殖和遷移更為重要。第三部分環(huán)孢素A和人參皂甙Rb1干預(yù)對(duì)MCT致PAH大鼠PASMCs的增殖、遷移和凋亡的影響目的:從動(dòng)物水平觀察Cs A或Rb預(yù)處理對(duì)MCT致PAH大鼠PASMCs增殖、凋亡和遷移的影響,以進(jìn)一步明確Ca N-NFAT信號(hào)通路在大鼠MCT致PAH發(fā)病過(guò)程中的作用,為PH治療提供新的靶向藥物。方法:大鼠以50 mg/kg MCT單次腹腔注射,在造模的第一天同時(shí)予以25mg/kg Cs A或40 mg/kg Rb1,每天腹腔注射共21d,之后原代培養(yǎng)PASMCs,采用:(1)血流動(dòng)力學(xué)和形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法,測(cè)定大鼠RVSP、RVP、RVMI和PAs形態(tài)的變化;(2)Fluo-3熒光檢測(cè)[Ca2+]i方法,測(cè)定CPA誘導(dǎo)大鼠PASMCs胞膜[Ca2+]i升高的作用;(3)熒光定量PCR、Western Blot和免疫熒光檢測(cè)方法,測(cè)定大鼠PASMCs Ca N-NFAT m RNA和蛋白表達(dá)水平的變化;(4)MTS和PCNA法,測(cè)定大鼠PASMCs的增殖情況;(5)transwell小室測(cè)定大鼠PASMCs的遷移情況;(6)Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)大鼠PASMCs的凋亡。結(jié)果:與MCT組相比,(1)Cs A干預(yù)MCT大鼠(Cs A-MCT組)的RVSP、RVP和RVMI顯著降低,而且肺內(nèi)小動(dòng)脈管壁變薄,管腔增大,提示Cs A干預(yù)能抑制MCT致PAH大鼠模型;(2)Cs A-MCT組PASMCs的NFATc3/4蛋白表達(dá)顯著下降,提示Cs A干預(yù)抑制PAH的NFATc3/4表達(dá)上調(diào);(3)Cs A-MCT組的PASMCs增殖和遷移能力降低、凋亡水平增強(qiáng),提示Cs A可通過(guò)抑制Ca N-NFAT信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)PAH的肺動(dòng)脈重構(gòu)。與MCT組相比,(1)Rb1干預(yù)MCT致PAH大鼠(Rb1-MCT組)的RVSP、RVP和RVMI顯著降低,肺內(nèi)小動(dòng)脈管壁變薄,管腔增大,提示Rb1干預(yù)能抑制MCT致PAH大鼠模型;(2)Rb1-MCT組的PASMCs Ca NBβ-NFATc2/3/4m RNA和蛋白表達(dá)降低,NFATc1/5 m RNA表達(dá)也降低,提示Rb1干預(yù)抑制MCT致PAH大鼠Ca NBβ-NFAT表達(dá)上調(diào);(3)Rb1抑制CPA誘導(dǎo)MCT致PAH大鼠PASMCs胞漿[Ca2+]i升高的作用,提示Rb1抑制PAH大鼠PASMCs的SOCE功能的增強(qiáng);(4)Rb1抑制MCT致PAH大鼠PASMCs的增殖和遷移,并促進(jìn)凋亡,提示Rb1干預(yù)抑制PAH PASMCs Ca2+-Ca N-NFAT介導(dǎo)的功能增強(qiáng)。結(jié)論:Cs A干預(yù)抑制MCT致PAH大鼠模型,并抑制大鼠PASMCs的增殖和遷移,促進(jìn)凋亡,其機(jī)制可能與Cs A干預(yù)下調(diào)MCT致PAH大鼠NFATc3/4的表達(dá)有關(guān)。Rb1通過(guò)抑制MCT致PAH大鼠PASMCs SOCE功能的增強(qiáng),抑制Ca2+-Ca NBβ-NFAT信號(hào)通路,發(fā)揮其抑制細(xì)胞增殖和遷移并促進(jìn)凋亡的作用,可能作為治療PAH的靶向藥物。綜上所述,Ca2+-Ca N-NFAT信號(hào)通路在MCT致PAH致病過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。NFATc2/4是細(xì)胞生長(zhǎng)增生所必需的,而NFATc2/3/4與PAH PASMCs的增殖密切相關(guān)。Rb1通過(guò)抑制MCT致PAH大鼠PASMCs SOCE的功能增強(qiáng),下調(diào)Ca NBβ NFAT信號(hào)通路信號(hào)分子的表達(dá),減輕血管重塑,抑制PAH病程。以上結(jié)果提示Ca2+-Ca N-NFAT信號(hào)通路在PAH發(fā)病過(guò)程中起重要作用,為指導(dǎo)PAH治療提供新依據(jù)和新靶點(diǎn),Rb1并可能成為治療PAH的新靶向藥物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R544.1

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