【摘要】：第一部分apo M單克隆抗體的制備目的:制備高親和力、高純度的小鼠抗人apo M的單克隆抗體。方法:選取6~8周齡、雌性BALB/c小鼠,每只小鼠以弗氏佐劑加apo M重組蛋白50mg/只進行初次免疫,每隔15天免疫1次,共免疫6次。于融合前4~5天,再次以弗氏不完全佐劑加apo M重組蛋白50mg/只加強免疫。選取檢測陽性的小鼠脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進行融合及選擇性培養(yǎng)。篩選陽性雜交瘤細(xì)胞并進行克隆化培養(yǎng),直至抗體分泌陽性率大于95%。利用小鼠腹腔接種法獲得含大量特異性抗體的腹水,經(jīng)Protein G柱純化,對抗體進行定量及特異性檢測。結(jié)果:經(jīng)篩選、融合、選擇性培養(yǎng)及亞克隆,成功獲得4株持續(xù)分泌特異性鼠抗人apo M單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。Western檢測結(jié)果顯示,在約25k D處4株單抗均有特異性條帶,與apo M重組蛋白的分子大小位置符合。進而選擇克隆號為1368CT871.72的雜交瘤,采用腹水誘生方案進行抗體的大量表達(dá)。腹水經(jīng)protein G柱純化后,apo M單抗蛋白含量為1mg/ml。Western blot檢測結(jié)果顯示,純化后的apo M單抗經(jīng)梯度稀釋后,在1:4000仍能檢測出目的蛋白。結(jié)論:制備的小鼠抗人apo M單克隆抗體具有很好的靈敏度和特異性。第二部分apo M+HDL的分離純化及其與SR-BI結(jié)合能力檢測目的:分離HDL組分中apo M+HDL和apo M-HDL顆粒,檢測apo M+HDL和apo M-HDL顆粒在體外與SR-BI的結(jié)合能力。方法:小鼠抗人apo M單克隆抗體通過共價結(jié)合方式不可逆的與Hi TrapNHS-activated HP 1 ml預(yù)裝柱結(jié)合,通過親和層析的方法,將HDL蛋白中apo M+HDL和apo M-HDL兩個組分分離,進而采用BCA蛋白定量方法對分離的蛋白進行定量分析。選取人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞經(jīng)體外PMA、ox-LDL誘導(dǎo),再經(jīng)apo M HDL、apo M+HDL、重組人apo M蛋白于37℃培養(yǎng)箱中分別孵育6 h,收集細(xì)胞并提取總蛋白,用抗SR-BI的單克隆抗體沉淀蛋白復(fù)合物后進行Western blot檢測。通過免疫共沉淀方法檢測apo M+HDL、apo M-HDL和重組apo M蛋白在THP-1細(xì)胞表面與SR-BI的相互作用。結(jié)果:人高密度脂蛋白HDL經(jīng)Hi Trap NHS-activated HP柱子純化,分別收集流出液(apo M HDL)、洗脫液(apo M+HDL),apo M抗體進行Dot blot及western檢測,結(jié)果顯示,在未經(jīng)純化的HDL蛋白、純化后第一、二、三管洗脫液中均能檢測到apo M蛋白,流出液(apo M HDL)組分中未檢測到apo M蛋白。apo M HDL、apo M+HDL蛋白經(jīng)透析后定量,終濃度分別為3.23 mg/ml和0.34 mg/ml,總體積為6.2ml和3.5ml。PMA處理THP-1細(xì)胞,其表面SR-BI的表達(dá)會有升高約10%左右,免疫共沉淀結(jié)果顯示,apo M HDL、apo M+HDL孵育組的總蛋白經(jīng)SR-BI抗體沉淀復(fù)合物中均能檢測到SR-BI和HDL蛋白,重組人apo M孵育組的總蛋白經(jīng)SR-BI抗體沉淀復(fù)合物中也能檢測到SR-BI和apo M蛋白。結(jié)論:經(jīng)HDL蛋白成功分離apo M HDL和apo M+HDL兩種蛋白成分。證實THP-1細(xì)胞表面apo M HDL、apo M+HDL和重組人apo M與SR-BI蛋白之間存在相互作用。第三部分apoM+HDL對巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響及可能的作用機制目的:擬利用體外誘導(dǎo)人單核細(xì)胞株THP-1分化為巨噬細(xì)胞,進而構(gòu)建體外泡沫細(xì)胞模型。分別利用apo M+HDL和apo M-HDL蛋白進行刺激,luminex 200分析apo M+HDL和apo M-HDL對炎癥因子的影響,并結(jié)合全基因組芯片掃描分析可能的作用機制。方法:(1)以PMA誘導(dǎo)人THP-1細(xì)胞株分化為巨噬細(xì)胞,經(jīng)ox-LDL負(fù)載24hr,經(jīng)油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)情況。(2)apo M+HDL和apo M-HDL蛋白分別刺激誘導(dǎo)后的THP-1 24hr,取細(xì)胞上清液,利用luminex技術(shù)檢測TNF-α、IL-10、IL-6、IL-1β、MCP-1的表達(dá)情況。(3)收集上述處理的細(xì)胞,抽提m RNA,利用人基因表達(dá)譜芯片(Gene Chip#174;Prime View?Human Gene Expression Array)分析apo M+HDL、apo M-HDL及對照組三組之間活化的信號通路的差異。結(jié)果:(1)與對照組相比,人THP-1細(xì)胞株在PMA、ox-LDL誘導(dǎo)下,細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積明顯,泡沫細(xì)胞模型誘導(dǎo)成功。(2)luminex檢測結(jié)果顯示:apo M+HDL和apo M-HDL均能下調(diào)巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1的表達(dá)。apo M+HDL對TNF-α、IL-6、IL-1β的下調(diào)作用與apo M-HDL相比更為顯著(P值分別為0.0411、0.0002和0.0101),同時發(fā)現(xiàn)與對照組相比,apo M+HDL顯著上調(diào)IL-10的表達(dá)(P=0.0066)。(3)apo M+HDL、apo M-HDL及對照組相比,上調(diào)基因分別為309個和287個。根據(jù)KEGG與BIOCARTA中所有pathway的基因信息,將差異基因進行富集分析,apo M+HDL和apo M-HDL刺激組活化的信號途徑基本一致,與對照組相比,活化的信號途徑主要為細(xì)胞因子信號途徑、MAPK信號途徑。apo M-HDL和apo M+HDL刺激組相比,上調(diào)基因數(shù)為2個,分別為MMP-12、MMP-7,下調(diào)基因數(shù)為7個,分別為ZNF451、TSPYL1、IREB2、CCNL2、UTY、EZH1、RBM6,由于差異基因數(shù)量太少,無法進行pathway分析。結(jié)論:與apo M-HDL相比,apo M+HDL抗炎作用更為顯著。apo M+HDL和apo M-HDL處理組活化的信號途徑主要為細(xì)胞因子/細(xì)胞因子受體信號途徑、MAPK信號途徑、粘附分子信號途徑。apo M+HDL可能在促進斑塊穩(wěn)定性方面具有一定的作用。第四部分apo M的表達(dá)調(diào)節(jié)及其與冠心病的易感性目的:探討啟動子區(qū)的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)在體內(nèi)對apo M表達(dá)調(diào)節(jié)作用及其對冠心病(CAD)易感性的影響。方法:采用PCR產(chǎn)物直接測序的方法對206例冠心病患者和209例健康對照者apo M基因啟動子進行序列分析。同時采用生化方法檢測研究對象的血脂水平。利用基因重組和定點突變技術(shù)構(gòu)建含apo M啟動子SNP的報告基因質(zhì)粒,采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)觀察各SNP位點對apo M基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果:分析了apo M基因啟動子區(qū)4個SNP位點T-1628G,C-1065A,T-855C和T-778C與冠心病的相關(guān)性,同時還發(fā)現(xiàn)了一個新的缺失突變(-724del C)。冠心病組-1628G、-855C和-724del C等位基因頻率(分別為19.2%、22.8%和8.0%)均明顯高于對照組(分別為12.7%、15.6%和4.1%),P值分別為0.011、0.008和0.017。-855C突變基因攜帶者血漿總膽固醇水平顯著高于TT基因型(P=0.000)。-724del等位基因攜帶者血漿總甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)水平明顯升高(P值分別為0.003和0.000),而HDL水平下降(P=0.044),進一步研究證實,-855和-724位點發(fā)生突變后,啟動子活性明顯下降(P值分別為0.012和0.009)。結(jié)論:apo M基因啟動子T-855C和-724del C多態(tài)性顯著降低啟動子轉(zhuǎn)錄活性,導(dǎo)致apo M蛋白表達(dá)水平下降,進而可能影響體內(nèi)HDL和膽固醇的代謝,增加冠心病的易感性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R541.4

【共引文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 謝彬;呂湛;;ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1研究進展[J];國際內(nèi)科學(xué)雜志;2009年01期

2 秦媛媛;凌文華;;B族Ⅰ型清道夫受體與高密度脂蛋白代謝[J];國際內(nèi)科學(xué)雜志;2009年05期

3 唐艷麗;邵予;孫萬邦;;基質(zhì)金屬蛋白酶在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫致病機制及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的研究進展[J];廣東醫(yī)學(xué);2013年17期

4 郭麗娜;張瑞鑫;程俐芬;曹寧賢;任有蛇;;附睪中脂質(zhì)運載蛋白家族的研究進展[J];中國畜牧獸醫(yī);2013年10期

5 劉建青;寧保安;高志賢;;Lipocalin核糖體展示文庫的構(gòu)建及雌二醇特異性模擬抗體的篩選[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年31期

6 吳兆華;;基質(zhì)金屬蛋白酶-10在急性腦梗塞患者血清中表達(dá)的意義[J];北方藥學(xué);2014年04期

7 張妍;劉曉敏;李麗;柯丹;趙學(xué)剛;梁波;張利霞;;系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究[J];標(biāo)記免疫分析與臨床;2014年02期

8 陳艷芬;郭姣;姚紅霞;楊超燕;唐春萍;王潔;明露;;復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂膠囊對非酒精性脂肪肝LXR-α和SREBP-1c表達(dá)的影響[J];廣東藥學(xué)院學(xué)報;2014年04期

9 徐德超;高翔;梅長林;;中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白與慢性腎臟病[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2015年03期

10 郭真真;李宗莊;操群安;戴秋艷;;尼古丁聯(lián)合血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)老年小鼠腹主動脈瘤形成的研究[J];國際心血管病雜志;2015年04期

相關(guān)會議論文 前1條

1 丁楊;Wei Wang;Jianping Zhou;;仿生型納米載體介導(dǎo)的靶向siRNA遞送系統(tǒng)的研究(英文)[A];第十一屆全國博士生學(xué)術(shù)年會（生物醫(yī)藥專題）論文集（上冊，大會報告）[C];2013年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 栗炳南;rAAV_2同時介導(dǎo)apoAI與SR-BI雙基因?qū)用}硬化治療作用的研究[D];中南大學(xué);2011年

2 陳韶華;PPARα基因V227A變異在肝細(xì)胞中的生物學(xué)作用及其機制研究[D];浙江大學(xué);2011年

3 蔣波;葡糖胺對載脂蛋白M代謝的影響和機制研究[D];蘇州大學(xué);2011年

4 郭志剛;ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子A1（ABCA1）對炎癥因子的調(diào)節(jié)機制及其臨床意義[D];南方醫(yī)科大學(xué);2007年

5 董靜;煙酸促進膽固醇逆轉(zhuǎn)運在體和離體研究[D];中南大學(xué);2008年

6 祁莉萍;ABCA1、SR-BI基因多態(tài)性與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的關(guān)聯(lián)研究及對膽固醇逆向轉(zhuǎn)運功能影響的機制探討[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2008年

7 萬晶晶;Ghrelin對巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成的抑制作用及其機制研究[D];華中科技大學(xué);2009年

8 魏靜元;載脂蛋白CⅢ轉(zhuǎn)基因小型豬高脂血癥模型的建立與表型初步分析[D];吉林大學(xué);2010年

9 杜瑞雪;瑞舒伐他汀對頸動脈粥樣硬化斑塊的影響及抗炎作用[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院;2010年

10 彭振宇;吸煙對巨噬細(xì)胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運影響的在體和離體研究[D];中南大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張曉菲;ABCA1胞外第一環(huán)缺失突變體構(gòu)建及其抗砷性研究[D];石河子大學(xué);2010年

2 田露;葉酸與運動對飲食性高同型半胱氨酸血癥大鼠血脂、抗氧化能力影響[D];北京體育大學(xué);2011年

3 胡凱;茶葉功能性成分體外降血脂的機理研究[D];華南理工大學(xué);2011年

4 楊平;阿托伐他汀對急性腦梗死患者的療效及其調(diào)脂效應(yīng)與ABCA1基因R219K多態(tài)性的關(guān)系[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2011年

5 鐘建開;普羅布考在動脈粥樣硬化模型中改善高密度脂蛋白功能的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2011年

6 逄孝敬;腦血管病患者責(zé)任血管病變神經(jīng)影像學(xué)檢查的評估[D];泰山醫(yī)學(xué)院;2011年

7 易彥;ABCA1基因多態(tài)性及相關(guān)危險因素與腦梗死關(guān)聯(lián)的實驗研究[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2011年

8 燕濤;保膽取石（息肉）術(shù)后結(jié)石（息肉）復(fù)發(fā)危險因素病例對照研究[D];蘇州大學(xué);2011年

9 周立堯;氧化修飾對高密度脂蛋白功能的影響及與ABCA1的關(guān)系[D];南方醫(yī)科大學(xué);2007年

10 杜會芹;ApoE~（-/-）/LDLR~（-/-）小鼠脂代謝、糖代謝關(guān)鍵基因表達(dá)研究[D];山東師范大學(xué);2008年

，

本文編號：2280618