【摘要】：盡管心臟手術和藥物治療取得了顯著進步,心肌梗死(myocardial infarction,MI)等心血管疾病仍然是導致全球人類死亡的主要原因之一。MI可造成大量心肌細胞(cardiomyocytes,CMs)不可逆轉(zhuǎn)性損失,然而成體心肌細胞幾乎沒有再生能力,所以心肌修復受限于可替代性的CMs來源。多能性干細胞(pluripotent stem cells,PSCs)包括胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)和誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)具有自我更新和向三胚層細胞(包括CMs)分化的能力可為治療心肌梗死等心臟疾病、藥物發(fā)現(xiàn)和心臟毒性篩選等提供細胞來源。然而相對于ESCs,人i PSCs(hiPSCs)可來源于成體各個組織,細胞來源方便和廣泛,還避免了倫理問題,因此hiPSCs源性心肌細胞(hiPSC-CMs)將有助于為心肌梗死等心血管疾病治療提供潛在的細胞來源。但目前研究認為,hPSCs-CMs類似于胎兒或胚胎期CMs,在結(jié)構和功能上具有不成熟性,可能導致心律不齊、代謝紊亂等問題,嚴重制約其臨床應用的可能性。目前應用于促進幼稚型CMs(干細胞源性CMs和新生CMs等)成熟的方法有:長時間體外培養(yǎng)、添加化學因子、施加機械拉力和電刺激等,但收效甚微。眾所周知,在心臟發(fā)育和成熟過程中不僅受到生理因素、旁分泌激素的影響,還受到機械因素的作用。心組織的彈性模量從胚胎到新生再到成體的過程中逐漸增加,以適應心臟正常生理功能,然而在梗死區(qū)的進一步增加,反而產(chǎn)生不良效果。但目前尚未見基質(zhì)硬度對hiPSCs-CMs成熟性的全面報道。有報道稱,模擬正常心肌硬度可促進大鼠新生CMs的收縮功能的成熟,這提示模擬正常心肌硬度可能會促進hiPSCs-CMs成熟。在考慮促成熟策略之前,我們以成熟(成體)和未成熟(胎兒)CMs特征的差異性作為評判hiPSC-CMs成熟狀態(tài)的基準。成熟性CMs結(jié)構和功能特征主要體現(xiàn)在(1)有序的肌節(jié),肌節(jié)是CMs形態(tài)和收縮的結(jié)構和功能單位;(2)強健的鈣瞬變,鈣瞬變是興奮-收縮偶聯(lián)的功能基礎,廣泛用于衡量CMs的功能;(3)增殖性低;(4)基因表達譜,成體結(jié)構基因表達增多;(5)成熟的能量供應站—線粒體,其結(jié)構和功能的改變是心臟成熟的關鍵部分。基于以上考慮,本研究擬以“基質(zhì)硬度是影響干細胞源性心肌細胞成熟的重要因素”為立足點,通過基質(zhì)硬度對hiPSC-CMs的肌節(jié)、基因和蛋白表達、鈣瞬變、增殖性和線粒體結(jié)構和功能的影響及機制的研究,評估基質(zhì)硬度對hiPSC-CMs成熟度的影響,探討獲得成熟度較高hiPSC-CMs的方法,為干細胞移植治療心肌疾患的臨床應用提供實驗依據(jù),以推動干細胞治療的臨床應用。第一部分化學成分既定方法誘導hiPSC-CMs的成熟性目的:通過化學成分既定的方法誘導hiPSCs為CMs,評估常規(guī)誘導CMs的成熟性。方法:使用mTeSR培養(yǎng)基復蘇培養(yǎng)hiPSCs細胞系(20代),每天換液。使用Versene無酶消化液分離傳代hiPSCs,通過免疫熒光染色和流式細胞儀檢測hiPSCs的多能性。采用化學成分既定的方法即添加Wnt信號通路激活劑CHIR99021和抑制劑IWR-1,在RPMI1640和B27培養(yǎng)基下誘導hiPSCs為CMs,利用倒置相差顯微鏡觀察細胞搏動,通過免疫熒光染色和流式細胞儀檢測CMs標志性分子表達,通過透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,EM)觀察CMs亞纖維結(jié)構,并通過Edu染色檢測CMs的增值性。結(jié)果:hiPSCs呈集落性生長,長勢極快。免疫熒光學染色檢測干細胞多能性標志分子SSEA-4和OCT3/4表達陽性,流式細胞儀檢測SSEA-4表達量為99.3%,OCT3/4表達量為98.0%。誘導8-10天可觀察到CMs的區(qū)域性搏動,第12天左右以同一頻率搏動。免疫熒光染色可見CMs結(jié)構性標志分子心肌肌鈣蛋白(cardiac troponin T,cTnT)和肌動蛋白(α-Actinin(Sarcomeric),a-Actinin)表達陽性,但細胞形態(tài)多樣,肌節(jié)排列不規(guī)則。流式細胞儀檢測cTnT陽性表達率可達90%以上,而不成熟CMs標志分子平滑肌肌動蛋白(α-Smooth Muscle Actin,a-SMA)表達為99.2%。EM顯示肌節(jié)呈片段狀存在并由片段化的Z線連接,不存在橫線管等結(jié)構。Edu染色顯示部分CMs呈陽性表達。結(jié)論:通過化學成分既定的方法可誘導hiPSCs為CMs,效率可達90%左右,但CMs具有不成熟性。第二部分基質(zhì)硬度對hiPSC-CMs成熟性的影響目的:在體外模擬正常和梗死心肌硬度條件下,通過檢測基質(zhì)硬度對hiPSC-CMs肌原纖維分布、肌節(jié)結(jié)構、心肌結(jié)構蛋白和基因的表達、鈣瞬變和細胞增殖性的作用,評估基質(zhì)硬度對hiPSC-CMs成熟性的影響。方法:將聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)基底膠與固化劑以30:1和60:1的比例混合,分別制成硬(Stiff PDMS)和軟(Soft PDMS)基質(zhì)分別模擬心肌梗死和正常心肌硬度,并使用聚乙烯亞/聚(4-苯乙烯磺酸)(PEI/PSS)進行親水化表面處理。通過倍增時間和細胞粘附率檢測hiPSCs在PDMS上的粘附和增殖性。將hiPSCs接種在Stiff PDMS和Soft PDMS上,組織培養(yǎng)皿(TCPs)作為對照。通過化學既定的方法誘導hiPSCs為CMs。30天后,通過倒置相差顯微鏡觀察不同基質(zhì)硬度下CMs自發(fā)搏動率。通過免疫熒光染色和透射電子顯微鏡觀察hiPSC-CMs肌原纖維排列和肌節(jié)結(jié)構;通過流式細胞儀、蛋白免疫印跡(WB)和Human Transcriptome Array 2.0(HTA2.0)檢測心肌結(jié)構蛋白和基因的表達以及全基因表達譜。通過Fura-2檢測hiPSC-CMs鈣瞬變,并通過WB和HTA2.0檢測鈣相關蛋白和基因的表達變化。通過Ed U標記染色和ki67流式細胞儀檢測hiPSC-CMs細胞周期活動。結(jié)果:hiPSCs在Soft PDMS和Stiff PDMS的貼壁率均可達99%以上,沒有顯著性差異。在TCPs、Soft PDMS和Stiff PDMS中hiPSCs增殖的倍增時間沒有顯著性差異,分別為:19.28±0.48h,19.67±1.05h和18.56±0.72h。hiPSC-CMs在TCPs和Stiff PDMS的平均搏動速率約為35次/min,而在Soft PDMS的搏動次數(shù)多為60次/min。α-Actinin和cTnT的免疫熒光染色和透射電子顯微鏡顯示在Soft PDMS上肌原纖維排列更加有序,肌節(jié)長度沒有明顯改變,但Z線長度從TCPs上的0.28±0.09μm增長到Soft PDMS上的0.56±0.15μm。流式細胞儀結(jié)果顯示cTnT陽性率在TCPs、Stiff PDMS和Soft PDMS上分別為89.49±3.13%,89.56±3.24%和96.13±1.40%,并且Soft PDMS上cTnT和α-Actinin共表達率升高,在TCPs、Stiff PDMS和Soft PDMS上分別為73.70±2.11%,80.40±3.62%和92.40±2.43%。流式細胞儀和WB結(jié)果均顯示在Soft PDMS上心臟結(jié)構基因表達增加,HTA2.0結(jié)果顯示結(jié)構基因表達雖有所增高,但并沒有顯著性差異;而原始心肌標志分子a-SMA表達卻顯著性降低。HTA2.0檢測全基因表達譜沒有顯著性改變。hiPSC-CMs呈現(xiàn)穩(wěn)健的、低緩的鈣瞬變曲線,曲線上升和下降均以較慢的速率進行。Soft PDMS中鈣瞬變上升(dep v)和下降(ret v)曲線速率明顯升高,幅度(peak h)也增加,相對應的曲線下降所需要的時間sin exp tau減小;鈣瞬變相關蛋白和基因表達均升高。EdU標記hiPSC-CMs處于分裂期的細胞比例分別為:21.82±1.46%,12.75±1.68%和7.97±2.89%;ki67流式細胞儀檢測處于細胞周期的細胞比例分別為27.08±2.45%,26.13±1.76%和17.61±1.42%。結(jié)論:基質(zhì)硬度對hiPSCs的增殖性和貼壁率沒有影響。Soft PDMS促使心肌細胞搏動頻率趨于正常CMs搏動頻率,Soft PDMS促細胞形態(tài)結(jié)構的成熟性:肌原纖維排列有序,肌節(jié)長度雖不變但Z線增長,結(jié)構蛋白表達增加。Soft PDMS促進hiPSC-CMs的功能性成熟:鈣瞬變增強,鈣相關蛋白增加,增值性減弱。第三部分基質(zhì)硬度hiPSC-CMs線粒體的影響目的:線粒體和功能的改變是CMs成熟的關鍵部分。通過基質(zhì)硬度對hiPSC-CMs線粒體結(jié)構和功能影響的研究,探討基質(zhì)硬度與線粒體成熟性的關系。方法:使用線粒體綠色熒光探針(MTG)標記活細胞線粒體形態(tài),通過線粒體標志性分子Tom20結(jié)合肌原纖維標記物α-Actinin進行免疫熒光染色,顯示線粒體在hiPSC-CMs的結(jié)構關系。透射電子顯微鏡觀察線粒體在基質(zhì)硬度對線粒體結(jié)構的影響,WB和HTA2.0檢測線粒體結(jié)構蛋白和基因的表達。通過TMRE和MTG檢測基質(zhì)硬度下線粒體膜電位。ATP lite Luminescence Assay System(ATP lite)檢測基質(zhì)硬度下hiPSC-CMs的細胞內(nèi)ATP產(chǎn)量,并通過WB和HTA2.0檢測氧化磷酸化復合體蛋白和基因的表達,采用seahorse system檢測線粒體耗氧補償率OCR。CM-H2DCFDA與線粒體遠紅熒光探針MTDR檢測線粒體超氧化物水平。Rhod-2和MTG檢測線粒體鈣表達水平。溶酶體遠紅熒光探針LTDR和MTG檢測溶酶體表達量。細胞色素C和Tom20共定位免疫熒光染色檢測線粒體凋亡作用。結(jié)果:MTG標記發(fā)現(xiàn)在Soft PDMS上線粒體呈更延長和交互的網(wǎng)狀結(jié)構,而在對照組中線粒體更多地呈現(xiàn)短棒狀等形態(tài)。Tom20和a-Actinin的免疫熒光染色顯示基質(zhì)越硬線粒體越傾向于圍繞在細胞核周圍,與不規(guī)則或圈形排列的肌原纖維具有較少的關聯(lián),而在Soft PDMS上,線粒體以線性的形態(tài)向細胞縱軸延伸,并且分布在肌原纖維之間。透射電子顯微鏡顯示Soft PDMS上線粒體具有層狀嵴,線粒體長度和面積,以及線粒體嵴的長度均具有顯著性增長。相對于其他兩組,在Soft PDMS中ATP lite檢測到細胞內(nèi)ATP產(chǎn)量稍高,WB和HTA2.0檢測相應的氧化連酸化復合物的蛋白和基因水平表達升高;線粒體膜電位勢能顯著性增強;并且提高了線粒體耗氧補償率,增加基礎呼吸和最大呼吸量。Soft PDMS可降低線粒體活性氧和鈣的積累,以及減少溶酶體表達量。免疫熒光染色并未發(fā)現(xiàn)細胞色素C從線粒體中釋放,并且HTA2.0顯示在Soft PDMS上細胞凋亡受到抑制。結(jié)論:Soft PDMS促進hiPSC-CMs線粒體的成熟:線粒體形態(tài)延長,層狀嵴結(jié)構,線粒體膜電位升高,氧化磷酸化能力提高,耗氧補償率增加和有害物質(zhì)清除力增強。第四部分Soft PDMS促進hiPSC-CMs成熟的機制目的:通過檢測機械轉(zhuǎn)導子YAP/TAZ,在基質(zhì)硬度上hiPSC-CMs中的表達變化,探討基質(zhì)硬度通過YAP/TAZ調(diào)節(jié)hiPSC-CMs成熟的可能性;通過激活/抑制Wnt信號通路,檢測YAP/TAZ和線粒體形態(tài)功能的變化,進一步探討在hiPSC-CMs誘導分化過程中涉及的Wnt信號通路和基質(zhì)硬度下YAP/TAZ以及線粒體動態(tài)間的作用關系,闡明Soft PDMS促進hiPSC-CMs成熟的機制。方法:通過WB檢測各組線粒體融合標志性分子Mfn2和Opa1,分裂標志分子Drp1以及YAP、TAZ和磷酸化YAP的表達。免疫熒光染色檢測YAP在細胞內(nèi)定位。通過HTA2.0檢測Wnt信號通路,Hippo信號通路和差異性基因的表達。在Soft PDMS和TCPs中分別添加Wnt信號通路的抑制劑IWR-1和激活劑CHIR99021,通過MTG標記檢測線粒體形態(tài),通過TMRE標記檢測線粒體膜電勢,WB檢測YAP/TAZ和Mfn2和Drp1的表達變化。結(jié)果:在Soft PDMS中,WB發(fā)現(xiàn)Mfn2和Opa1表達升高,Drp1降低。YAP免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)各基質(zhì)硬度下均細胞核定位,HTA2.0檢測可見在Soft PDMS上YAP基因表達稍低,而TAZ稍高,但均沒有顯著性差異;WB檢測YAP蛋白表達稍低,但TAZ蛋白顯著性升高。在TCPs中添加CHIR后,線粒體形態(tài)延長,線粒體膜電勢相對增高,Mfn2表達升高,Drp1和YAP/TAZ表達降低;在Soft PDMS中添加IWR-1后,線粒體形態(tài)縮短,線粒體膜電勢相對降低,Mfn2表達降低,Drp1和YAP/TAZ表達上調(diào),但以上表達變化均沒有統(tǒng)計學意義。結(jié)論:基質(zhì)硬度上調(diào)節(jié)Wnt信號通路誘導hiPSCs向hiPSC-CMs分化成熟過程中,存在Wnt信號通路、線粒體動態(tài)和YAP/TAZ交互關系網(wǎng)絡:抑制Wnt信號通路,降低線粒體融合和增加YAP/TAZ表達。總之,Wnt信號通路,線粒體動態(tài)和YAP/TAZ之間的交互作用促使Soft PDMS上的hiPSC-CMs更有序的肌節(jié)排列,增強鈣瞬變,降低增殖性,延長線粒體形態(tài),改善線粒體結(jié)構,增強線粒體功能,從而促進hiPSC-CMs的成熟性。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R54

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本文編號：2246035