發(fā)布時(shí)間：2018-09-08 16:52

【摘要】：目的:通過檢測(cè)不同危度骨髓增生異常綜合征患者及健康人體內(nèi)Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子在外周血及骨髓中的表達(dá)水平,分析Th17細(xì)胞數(shù)量與MDS患者血液學(xué)指標(biāo)之間的相關(guān)性,體外研究重組人IL-17刺激前后MDS患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CD3+CD8+細(xì)胞相關(guān)效應(yīng)分子表達(dá)水平的變化,進(jìn)而探索并闡明Th17細(xì)胞在MDS發(fā)病機(jī)制中的作用。背景:骨髓增生異常綜合征(Myelodysplastic syndromes,MDS)是血液系統(tǒng)常見的惡性病之一,是一組以骨髓無效造血和病態(tài)造血、進(jìn)展性骨髓衰竭并伴有遺傳學(xué)及分子學(xué)異常且不同風(fēng)險(xiǎn)向急性白血病轉(zhuǎn)化為特點(diǎn)的異質(zhì)性疾病,也是起源于造血系統(tǒng)的惡性克隆性疾病。大量研究表明T淋巴細(xì)胞數(shù)量及功能的異常在其發(fā)病機(jī)制中起重要作用,我們實(shí)驗(yàn)組前期研究發(fā)現(xiàn)MDS患者體內(nèi)輔助性T細(xì)胞Th1、Th2及二者比值、NK細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞均出現(xiàn)數(shù)量和(或)功能上的異常。Th17細(xì)胞是一種近年發(fā)現(xiàn)的輔助性T細(xì)胞家族中的一員,維甲酸相關(guān)孤核受體γt(Retinoid-related Orphan nuclear Receptorγt,RORγt)是其進(jìn)行分泌活動(dòng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,Th17細(xì)胞的命名由其特異性分泌的IL-17而來,同時(shí)其增殖、分化及分泌功能受IL-23、IL-6及信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal Transducer and Activator of Transcription-3,STAT-3)調(diào)控。Th17細(xì)胞在炎癥性疾病及自身免疫性疾病中扮演重要角色已在大量文獻(xiàn)數(shù)據(jù)中得到證實(shí)。近幾年,相關(guān)研究陸續(xù)證實(shí)了Th17細(xì)胞在惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用,但其究竟發(fā)揮抗腫瘤免疫作用還是發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用及通過何種途徑發(fā)揮作用尚存在爭(zhēng)議。MDS作為一種常見的惡性血液系統(tǒng)疾病,Th17細(xì)胞在其發(fā)病機(jī)制中的作用罕有研究。因此,本研究將MDS患者分為低危組MDS(low risk MDS,L-MDS,包括低危及中危-1MDS患者)和高危組MDS(high risk MDS,H-MDS,包括中危-2和高危MDS組)兩組,通過檢測(cè)L-MDS和H-MDS患者及健康對(duì)照者Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子在外周血及骨髓中的表達(dá)水平,分析Th17細(xì)胞數(shù)量與MDS患者的血液學(xué)指標(biāo)之間的相關(guān)性,并應(yīng)用重組人IL-17(human recombinant IL-17,rhIL-17)刺激MDS患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)而檢測(cè)刺激前后CD3+CD8+細(xì)胞相關(guān)效應(yīng)分子表達(dá)水平的變化,進(jìn)而探索并闡明Th17細(xì)胞在MDS發(fā)病機(jī)制中的作用。材料與方法:我們首先應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)35名MDS患者(L-MDS患者18名,h-mds患者17名)和18名健康對(duì)照(healthycontrol,hc)外周血及骨髓中以cd3+cd4+il-17+為流式標(biāo)記的th17細(xì)胞比例(th17細(xì)胞/cd3+cd4+細(xì)胞),進(jìn)而應(yīng)用定量方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)42例mds患者和23名健康人細(xì)胞因子il-17、il-6、il-23在外周血血漿及骨髓上清中的濃度;提取外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell,pbmnc)及骨髓單個(gè)核細(xì)胞(bonemarrowmononuclearcell,bmmnc)中的總mrna,逆轉(zhuǎn)錄獲得cdna,采用sybrgreenii實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(rt-pcr)檢測(cè)與th17相關(guān)的效應(yīng)分子il-17及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子rorγt、stat-3mrna的表達(dá)水平以評(píng)估th17的功能和激活狀態(tài),將th17細(xì)胞數(shù)量與mds患者血液學(xué)指標(biāo)做相關(guān)性分析。以rhil-17模擬體內(nèi)il-17作用,體外刺激mds患者bmmnc并檢測(cè)刺激前后cd3+cd8+細(xì)胞(cytotoxictlymphocyte,ctl)中細(xì)胞毒性顆粒穿孔素(perforin,per)、顆粒酶(granzymeb,gb)及凋亡配體fasl表達(dá)率的變化,探索并闡明th17細(xì)胞在mds患者發(fā)病機(jī)制中的作用。結(jié)果:1.l-mds組患者pb中th17細(xì)胞比例(4.42±2.59%)明顯高于hc組(2.73±1.32%,p=0.006)及h-mds組(1.42±0.79%,p0.001),同時(shí)h-mds組th17細(xì)胞比例明顯低于hc組(1.42±0.79%vs2.73±1.32%,p=0.032);l-mds組患者bm中th17細(xì)胞比例(4.32±2.76%)顯著高于hc組(2.93±1.21%,p=0.018)及h-mds組(1.37±0.84%,p0.001),后兩者之間比較亦具有顯著性差異(2.93±1.21%vs1.37±0.84%,p=0.02)。l-mds組患者pb中th17細(xì)胞占t淋巴細(xì)胞的比例(2.12±0.90%)明顯高于hc組(1.47±0.63%,p=0.011)及h-mds組(0.92±0.63%,p0.001),同時(shí)h-mds組th17細(xì)胞占t淋巴細(xì)胞的比例明顯低于hc組(0.92±0.63%vs1.47±0.63%,p=0.031);l-mds組患者bm中th17細(xì)胞占t淋巴細(xì)胞的比例(2.26±1.05%)顯著高于hc組(1.56±0.63%,p=0.014)及h-mds組(1.04±0.69%,p0.001),后兩者之間比較亦有顯著性差異(1.56±0.63%vs1.04±0.69%,p=0.029)。染色體正常組mds患者bm中th17細(xì)胞比例(4.559±2.6839%)較異常組(1.343±0.651%)明顯升高(p0.001),pb中th17細(xì)胞比例染色體正常與異常組比較亦有顯著差異(4.631±2.519%vs1.399±0.748%,p0.001);染色體核型好、中、差3組pb中th17細(xì)胞比例分別為4.591±2.605%、2.450±1.217%、0.913±0.363%,兩兩比較p值均小于0.05,bm中th17細(xì)胞比例分別為4.686±2.661%、2.921±0.933%、0.882±0.441%,兩兩比較p值均小于0.05;l-mds組患者pb中th17比例與中性粒細(xì)胞絕對(duì)值(absoluteneutrophilcount,anc)、血紅蛋白(hemoglobin,hb)濃度均呈正相關(guān)(r=0.731,p=0.006;r=0.492,p=0.038),l-mds組患者bm中th17細(xì)胞比例與anc、hb濃度亦呈正相關(guān)(r=0.866,p0.001;r=0.478,p=0.045);mds患者bm及pb中th17細(xì)胞比例與患者bm涂片中原始細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)(r=0.7936,p0.001;r=0.7936,p0.0001)2.h-mds組患者pb血漿中il-17濃度(22.44±5.64pg/ml)明顯低于l-mds組(30.29±5.97pg/ml,p0.001)及hc組(28.11±4.64pg/ml,p=0.01);h-mds組患者bm中il-17濃度(131.67±49.71pg/ml)明顯低于l-mds組(199.71±61.49pg/ml,p0.001)及hc組(173.59±52.70pg/ml,p=0.015);h-mds組患者pb血漿中il-23濃度(42.77±13.35pg/ml)明顯低于l-mds組(66.21±20.54pg/ml,p0.001)及hc組(54.20±15.40pg/ml,p=0.030),后兩組比較p=0.019,h-mds組患者bm中il-23濃度(77.75±30.01pg/ml)明顯低于l-mds組(137.54±47.32pg/ml,p0.001)及hc組(106.96±36.69pg/ml,p=0.011),后兩組比較p=0.017,亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;h-mds組患者il-6(4.152±2.497pg/ml)明顯低于l-mds組(7.834±3.977pg/ml,p=0.001)及hc組(6.377±3.578pg/ml,p=0.038),h-mds組患者bm中il-6濃度(10.467±5.131pg/ml)明顯低于l-mds組(17.659±5.874pg/ml,p0.001)及hc組(14.550±4.483pg/ml,p=0.012),l-mds與對(duì)照組濃度比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.049)。3.l-mds組患者pbmnc中il-17的mrna相對(duì)表達(dá)量(11.81±4.77)明顯高于hc組(7.46±3.05,p=0.021)及h-mds組(4.72±2.91,p0.001),同時(shí)hc組與h-mds組之間存在顯著性差異(4.72±2.91vs7.46±3.05,p0.001);同樣,l-mds組患者bmmnc中il-17mrna的相對(duì)表達(dá)量(10.66±3.18)顯著高于hc組(8.78±2.84,p=0.035)及h-mds組(5.00±2.76,p0.001),后兩者之間比較亦存在顯著性差異(8.78±2.84vs5.00±2.76,p0.001)。l-mds組患者pbmnc中rorγtmrna的相對(duì)表達(dá)量(0.201±0.084)明顯高于hc組(0.148±0.069,p=0.016)及h-mds組(0.100±0.063,p0.001),同時(shí)h-mds組與hc組之間存在顯著性差異(0.100±0.063vs0.148±0.069,p=0.034);與pb一致,l-mds組患者bmmnc中rorγtmrna的相對(duì)表達(dá)量(0.406±0.180)顯著高于hc組(0.319±0.127,p=0.046)及h-mds組(0.187±0.097,p0.001),后兩者之間比較亦存在顯著性差異(0.319±0.127vs0.187±0.097,p=0.003)。l-mds組患者pbmnc中stat-3mrna的相對(duì)表達(dá)量(0.316±0.132)明顯高于hc組(0.240±0.123,p=0.032)及h-mds組(0.165±0.083,p0.001),同時(shí)h-mds組與hc之間存在顯著性差異(0.240±0.123vs0.165±0.083,p=0.037);l-mds組患者bmmnc中stat-3mrna的相對(duì)表達(dá)量(0.416±0.126)顯著高于hc組(0.329±0.146,p=0.042)及h-mds組(0.225±0.087,p0.001),后兩者之間比較差異亦有顯著性(0.329±0.146vs0.225±0.087,p=0.004)。4.l-mds組、h-mds組患者ctl占bmmnc百分比低于hc組(16.285±9.426%vs22.382±8.628%,15.589±7.906%vs22.382±8.628%,p值均小于0.05),l-mds與h-mds兩組間比較無顯著差異(p=0.8140.05);與ctl占單個(gè)核細(xì)胞百分比結(jié)果一致,l-mds組、h-mds組患者bm中ctl細(xì)胞占t淋巴細(xì)胞百分率低于hc組(37.209±12.213%vs46.759±14.439%,35.990±10.332%vs46.759±14.439%,p值均小于0.05),l-mds與h-mds兩組間比較亦無顯著差異(p=0.0770.05圖4.3)。mds患者bm中ctl細(xì)胞per、gb、fasl表達(dá)率與患者bm中原始細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)(r=-0.5443,p=0.0007;r=-0.6022,p=0.0001;r=-.5329,p=0.001),且與h-mds組比l-mds組ctl中per、gb、fasl表達(dá)率均顯著升高(4.607±3.560%vs2.373±2.290%,p=0.035;47.324±16.940%vs34.270±18.947%,p=0.039;14.570±7.894%vs9.391±6.378%,p=0.041)。mds患者bm中ctl的per、gb、fasl表達(dá)率與患者bm上清中il-17濃度呈正相關(guān)(r=0.4012,p=0.0169;r=3685,p=0.0294;r=0.5388,p=0.0008)。rhil-17刺激后bm中ctl的per、gb及fasl表達(dá)率均較刺激前明顯升高(4.56±4.23%vs3.52±3.17%,p0.01;59.47±16.47%vs40.61±18.98%,p0.01;13.94±10.58%vs12.11±8.69%,p0.05)。l-mds與h-mds組患者刺激前后per、gb、fasl表達(dá)率比值無顯著性差異(p值分別為0.161,0.27,0.98),同時(shí)刺激后h-mds組與刺激前l(fā)-mds組per、gb、fasl表達(dá)率比較無差異(p值分別為0.567,0.451,0.482)。結(jié)論:(1)th17細(xì)胞在mds發(fā)病中主要通過抑制惡性克隆起保護(hù)性作用;(2)th17細(xì)胞可能選擇性殺傷惡性克隆,在一定程度上解除了惡性克隆對(duì)正常造血的抑制,保持了正常造血克隆的相對(duì)優(yōu)勢(shì);(3)染色體異常組th17比例較染色體正常組顯著減低,且th17細(xì)胞比例越低,染色體惡性度越高,進(jìn)一步表明th17細(xì)胞可直接或間接殺傷畸變的惡性克隆。(4)th17細(xì)胞上游分子il-6、il-23水平異常可能是引起th17細(xì)胞數(shù)量功能異常的罪魁禍?zhǔn)?(5)Th17細(xì)胞可能通過IL-17/CTL途徑發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R551.3

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