【摘要】：研究背景血管新生在整個生命過程中都發(fā)揮著重要的作用,與胚胎發(fā)育、傷口愈合、動脈粥樣硬化斑塊失穩(wěn)定、腫瘤的發(fā)生發(fā)展等多種生理病理過程都密切相關(guān)。廣義的血管新生,又叫血管形成(vascularization),主要包括三種形式:血管生成(vasculogenesis)、血管新生(angiogenesis)和動脈形成(arteriogenesis)。其中血管新生(angiogenesis)是在既已存在的血管基礎(chǔ)上,通過血管內(nèi)皮細(xì)胞活化、增殖、遷移等最終以“出芽”的形式實現(xiàn)血管叢的擴(kuò)張。血管內(nèi)皮細(xì)胞除參與形成基本的血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)外,亦能分泌多種因子,形成特定的組織和細(xì)胞微環(huán)境,調(diào)節(jié)組織生長和修復(fù)。血小板是參與血管病變的重要細(xì)胞成分。血小板到達(dá)損傷的內(nèi)皮部位后迅速被激活,釋放出大量的血小板微粒(platelet microvesicles,PMVs)。PMVs是一群直徑為0.1-1.0μm大小的超微膜性囊泡,擁有與血小板類似的重要生物學(xué)功能,涉及體內(nèi)多種生理和病理反應(yīng)。近年來有研究顯示,PMVs還可通過攜帶多種促血管生成因子(VEGF、PDGF、bFGF等),增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成能力,誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化,促進(jìn)血管新生。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),金黃色葡萄球菌超抗原樣蛋白5(staphylococcal superantigen-like protein 5,SSL5)激活產(chǎn)生的PMVs可以促進(jìn)單核細(xì)胞中炎癥因子(IL-1β、TNFα、MCP-1及MMP-9)的表達(dá),誘發(fā)炎癥反應(yīng)。因此,我們推測PMVs調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞分泌譜的改變可能是其參與血管新生的另外一種新機(jī)制,旨在為更加全面地了解和認(rèn)識血小板功能提供新的實驗證據(jù),同時也為探索血管新生相關(guān)疾病的防治奠定基礎(chǔ)。研究內(nèi)容1.體外制備凝血酶受體活化肽6(thrombin receptor activator peptide 6,TRAP-6)激活的PMVs,采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行鑒定,BCA法進(jìn)行定量。培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),臺式液作為空白對照(Con),PMVs制備過程中的上清液作為溶劑對照(Sup),利用基質(zhì)膠管腔形成實驗檢測PMVs對HUVECs成管能力的影響;CCK8法檢測其對細(xì)胞增殖的影響;劃痕實驗和transwell遷移實驗檢測細(xì)胞的遷移狀況。2.培養(yǎng)HUVECs,臺式液作為空白對照,PMVs制備過程中的上清液作為溶劑對照,實時定量PCR檢測PMVs對HUVECs相關(guān)促血管生成因子(HIF-1a、VEGF-A、FGF-2、IL-8、MMPs)m RNA表達(dá)的影響,Western Blot檢測MMPs的蛋白表達(dá)水平,明膠酶譜法檢測MMPs的活性。同時利用抑制劑干擾MMPs的活性,以及CD40L、CD40和P-選擇素的中和性抗體干擾PMVs與HUVECs間CD40L/CD40和P-選擇素/PSGL-1的結(jié)合,研究其對HUVECs成管能力及遷移的影響。3.采用6-8周齡雄性C57BL/6J小鼠,于小鼠皮下注入基質(zhì)膠栓,在體研究PMVs的促血管新生作用。研究結(jié)果1.PMVs在體外具有顯著的促血管新生效應(yīng)。(1)PMVs較Con與Sup,可顯著增強(qiáng)HUVECs的成管能力,且呈劑量效應(yīng);(2)PMVs較Con可顯著促進(jìn)HUVECs的增殖,但其促增殖效應(yīng)與Sup相當(dāng),不呈劑量依賴性;(3)PMVs較Con與Sup,呈劑量依賴性地促進(jìn)HUVECs的遷移。2.PMVs體外促血管新生的機(jī)制。(1)PMVs對于HUVECs促血管生成相關(guān)因子(HIF-1α、VEGF-A、FGF-2、MMP-7、TIMP-1)m RNA的表達(dá)沒有影響;但可呈劑量依賴性地抑制IL-8 mRNA的表達(dá);(2)PMVs較Con與Sup,可顯著促進(jìn)HUVECs表達(dá)和分泌MMP-2/9,并增強(qiáng)其活性,呈劑量依賴關(guān)系;(3)MMPs全抑制劑GM6001可以明顯抑制PMVs對HUVECs的促成管和促遷移效應(yīng);(4)MMP-2特異性抑制劑抑制PMVs促成管和促遷移能力的作用強(qiáng)于MMP-9特異性抑制劑;(5)CD40L-CD40與P-selectin-PSGL-1的相互作用并不參與PMVs的促血管新生過程。3.PMVs促進(jìn)體內(nèi)血管新生的作用和相關(guān)機(jī)制(1)PMVs在體內(nèi)具有顯著的促血管新生效應(yīng);(2)MMPs全抑制劑GM6001可顯著抑制PMVs在體內(nèi)的促血管新生效應(yīng);此外,MMP-2特異性抑制劑的效果明顯優(yōu)于MMP-9特異性抑制劑。研究結(jié)論P(yáng)MVs在體內(nèi)外均具有顯著的促血管新生效應(yīng)。同時,PMVs的促增殖作用雖與Sup(溶劑對照)相當(dāng);但誘導(dǎo)遷移能力更加顯著,且呈劑量依賴效應(yīng)。在機(jī)制方面,PMVs主要通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞MMP-2/9的表達(dá),并上調(diào)其活性,降解細(xì)胞外基質(zhì),增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力,最終促進(jìn)血管新生;其中MMP-2發(fā)揮的作用可能更大。本研究闡述了PMVs參與血管新生的一種新機(jī)制,以期能更加全面地了解和認(rèn)識血小板功能,同時為血管新生相關(guān)疾病的防治奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Background Angiogenesis plays an important role in the whole life process, which is closely related to embryonic development, wound healing, atherosclerotic plaque instability, tumor development and other physiological and pathological processes. Vasculogenesis, angiogenesis, and arteriogenesis. Angiogenesis is the expansion of vascular plexus by activation, proliferation and migration of vascular endothelial cells on the basis of existing blood vessels. Vascular endothelial cells participate in the formation of basic vascular network besides the formation of vascular endothelial cells. Platelets are important cellular components involved in angiopathy. Platelets are activated rapidly when they reach the injured endothelium and release a large number of platelet microvesicles (PMVs). PMVs are a group of 0.1-diameter platelets. In recent years, studies have shown that PMVs can also enhance the proliferation, migration and lumen formation of endothelial cells and induce endothelial progenitor cells by carrying a variety of angiogenic factors (VEGF, PDGF, bFGF, etc.). Our previous study found that PMVs produced by staphylococcal superantigen-like protein 5 (SSL5) activation could promote the expression of inflammatory factors (IL-1 beta, TNF alpha, MCP-1 and MMP-9) in monocytes and induce inflammation. The alteration of cell secretion profile may be another new mechanism of its involvement in angiogenesis, aiming at providing new experimental evidence for a more comprehensive understanding of platelet function and laying a foundation for the prevention and treatment of angiogenesis-related diseases. Content 1. Preparation of thrombin receptor activator 6 (thrombin receptor activator) in vitro HUVECs were cultured in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), desktop solution was used as blank control (Con), supernatant during the preparation of PMVs was used as solvent control (Sup), and matrix colloidal formation test was used to detect the effect of PMVs on HUV. The effect of PMVs on HUVECs-related angiogenesis factors (HIF-1a, VEGF-A, VEGF-A) was detected by real-time quantitative PCR with the supernatant of PMVs preparation as solvent control. Effects of FGF-2, IL-8, MMPs)m RNA expression, Western Blot assay for MMPs protein expression and gelatin zymogram assay for MMPs activity. Inhibitors interfered with MMPs activity and neutralizing antibodies against CD40L, CD40 and P-selectin interfered with the binding of CD40L/CD40 and P-selectin/PSGL-1 between PMVs and HUVECs to study their tubing ability to HUVECs. The angiogenesis of PMVs was studied in vivo by subcutaneous injection of matrix glue in 6-8 weeks old male C57BL/6J mice. Results 1. PMVs had significant angiogenesis effect in vitro. (1) Compared with Con and Sup, PMVs could significantly enhance the tubule formation ability of HUVECs in a dose-dependent manner; (2) PMVs could significantly promote the angiogenesis of HUVECs compared with Con. The proliferation of HUVECs was similar to that of Sup in dose-dependent manner; (3) PMVs promoted the migration of HUVECs in a dose-dependent manner compared with Con and Sup; (2) PMVs promoted angiogenesis in vitro. (1) PMVs had no effect on the expression of HUVECs angiogenesis-related factors (HIF-1a, VEGF-A, FGF-2, MMP-7, TIMP-1) m RNA; however, PMVs did not affect the expression of HUVECs in a dose-dependent manner. Inhibiting IL-8 mRNA expression in a dose-dependent manner; (2) PMVs significantly increased the expression and secretion of MMP-2/9 in HUVECs compared with Con and Sup, and enhanced the activity of MMP-2/9 in a dose-dependent manner; (3) GM6001, a total inhibitor of MMPs, could significantly inhibit PMVs-mediated and migration-promoting effects on HUVECs; (4) MMP-2 specific inhibitors inhibited PMVs-mediated and migration-promoting effects. The interaction between CD40L-CD40 and P-selectin-PSGL-1 was not involved in the angiogenesis of PMVs. 3. The role of PMVs in promoting angiogenesis in vivo and its related mechanisms (1) PMVs had significant angiogenesis-promoting effect in vivo; (2) GM6001, a total inhibitor of MMPs, could significantly inhibit the angiogenesis of PMVs in vivo. In addition, the effect of MMP-2 specific inhibitors was significantly better than that of MMP-9 specific inhibitors. Conclusion PMVs have significant angiogenic effects in vitro and in vivo. At the same time, the proliferation-promoting effect of PMVs is similar to that of Sup, but the migration-inducing ability of PMVs is more significant and dose-dependent. By promoting the expression of MMP-2/9 in endothelial cells, up-regulating its activity, degrading extracellular matrix, enhancing the migration ability of endothelial cells, and ultimately promoting angiogenesis, MMP-2 may play a greater role. This study elaborated a new mechanism of PMVs involved in angiogenesis, in order to better understand and understand the function of platelets. It lays the foundation for prevention and treatment of angiogenesis related diseases.
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R54

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3 林萍章;PualJ.Pearson;RaymondCartier;KazuhiroHashimoto;HartzellV.Schaff;;內(nèi)膜再生過程中,內(nèi)皮細(xì)胞之反應(yīng)[A];海峽兩岸電子顯微學(xué)討論會論文專集[C];1991年

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本文編號：2214598