【摘要】：研究背景及目的眾多研究發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)晚期巨噬細(xì)胞的凋亡造成As斑塊形態(tài)學(xué)改變(尤其是帽/核比值的變小),影響斑塊易損性,從而造成斑塊不穩(wěn)定,是導(dǎo)致各種心血管疾病的重要原因。As斑塊中的巨噬細(xì)胞幾乎都變成了泡沫細(xì)胞,巨噬細(xì)胞/泡沫細(xì)胞凋亡導(dǎo)致細(xì)胞外脂質(zhì)核的發(fā)生和擴(kuò)大,在脂質(zhì)核的非細(xì)胞部分可發(fā)現(xiàn)凋亡殘留體[1-3]。誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡,對通過巨噬細(xì)胞凋亡建立As易損斑塊模型進(jìn)而了解As易損斑塊發(fā)生發(fā)展的分子機制奠定良好基礎(chǔ)。鑒于以往的眾多研究已得出的結(jié)論,即巨噬細(xì)胞凋亡和斑塊破裂的關(guān)系,從這層關(guān)系出發(fā),如果能成功誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡,那么就可以采取同樣的方法誘導(dǎo)斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞凋亡來建立動脈粥樣硬化易損斑塊模型,從而建立一個體外可控可量化的斑塊破裂模型,方法簡單易行。因此,我們嘗試一種方法來誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡,為后期建立類似于人類As病變的易損斑塊模型提供依據(jù)。大腸桿菌嘌呤核苷酸磷酸化酶(E.coli purine nucleoside phosphorylase,ePNP)基因有較強的細(xì)胞殺傷作用,因此一直是基因治療的熱點[1]。ePNP作為一種前藥轉(zhuǎn)換酶基因,能將某些腺嘌呤類似物,如fludarabine等轉(zhuǎn)化成高毒性能自由穿透細(xì)胞膜的代謝產(chǎn)物,從而對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,引起細(xì)胞死亡[4、5]。眾多研究已經(jīng)在肝癌,胰腺癌等腫瘤細(xì)胞中證實ePNP自殺基因系統(tǒng)良好的殺傷細(xì)胞作用[6-8]。由ePNP殺傷腫瘤細(xì)胞的原理,我們推測ePNP基因同樣可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡。因此,本實驗擬采用巨噬細(xì)胞特異表達(dá)的ePNP轉(zhuǎn)基因小鼠,探究自殺基因ePNP聯(lián)合前體藥物fludarabine對巨噬細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。實驗方法和結(jié)果1.自殺基因ePNP誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠巨噬細(xì)胞凋亡(1)實驗分ePNP轉(zhuǎn)基因小鼠組和野生型小鼠組,在體外培養(yǎng)的各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中分別加入濃度為0、0.125μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.Oμg/ml和2.0μg/ml的前體藥物氟達(dá)拉濱(fludarabine),采用活細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)檢測腹腔巨噬細(xì)胞加藥后的細(xì)胞存活率。CCK-8檢測顯示給藥后ePNP小鼠腹腔巨噬細(xì)胞存活率明顯下降,尤其在濃度為2.0μg/ml,細(xì)胞存活率僅為(10.8±0.8)%。(2)給ePNP轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠腹腔注射劑量分別為0、10mg/kg、20mg/kg、60mg/kg的fludarabine,一天兩次,給藥五天,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測加入fludarabine后腹腔巨噬細(xì)胞的凋亡情況。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示給藥后其腹腔巨噬細(xì)胞凋亡明顯增加,并且存在劑量效應(yīng)關(guān)系。(3)給ePNP轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠腹腔注射劑量分別為0、10mg/kg、20mg/kg、60mg/kg的fludarabine,一天兩次,共給藥五天,取材(肺、脾),采用原位凋亡檢測試劑盒(TUNEL法)檢測加入fludarabine后組織巨噬細(xì)胞(肺、脾)的凋亡情況。TUNEL結(jié)果也顯示給藥后其肺、脾巨噬細(xì)胞凋亡明顯增加,并且存在劑量效應(yīng)關(guān)系。CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL法均顯示野生型小鼠給藥后沒有明顯巨噬細(xì)胞凋亡。結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。2.SR-A1-ePNP 小鼠和 APOE-/-小鼠雜交培養(yǎng) SR-A1-ePNP/APOE-/-將篩選出的SR-A1-ePNP轉(zhuǎn)基因純合子小鼠和APOE-/-小鼠雜交,獲得的F1代中,經(jīng)鑒定為ePNP陽性的小鼠,繼續(xù)雜交,獲得的F2代中小鼠,采用普通PCR鑒定ePNP基因和APOE-/-基因。后代中ePNP陽性和APOE基因敲除的小鼠即為目的小鼠。結(jié)論自殺基因ePNP能在前體藥物fludarabine協(xié)同作用下,誘導(dǎo)SR-A1-ePNP轉(zhuǎn)基因小鼠巨噬細(xì)胞凋亡。
[Abstract]:BACKGROUND AND OBJECTIVE Numerous studies have found that apoptosis of macrophages in advanced atherosclerosis (As) causes morphological changes of As plaque (especially the decrease of cap/nucleus ratio) and affects plaque vulnerability, resulting in plaque instability, which is an important cause of various cardiovascular diseases. Macrophage/foam cell apoptosis leads to the occurrence and expansion of extracellular lipid nuclei. Apoptosis residues can be found in the non-cellular part of the lipid nucleus [1-3]. Basis. In view of the conclusions of many previous studies, that is, the relationship between macrophage apoptosis and plaque rupture, from this relationship, if macrophage apoptosis can be successfully induced, then the same method can be used to induce apoptosis of intraplaque macrophages to establish Atherosclerotic Vulnerable Plaque model, thereby establishing a body. Therefore, we try to find a way to induce macrophage apoptosis to provide a basis for the later establishment of vulnerable plaque model similar to human As lesions. Escherichia coli purine nucleoside phosphorylase (ePNP) gene has stronger cells. As a prodrug converting enzyme gene, ePNP can transform some adenine analogues, such as fludarabine, into metabolites with high toxicity and free penetration through cell membrane, thus producing toxic effects on cells and causing cell death. It was confirmed that ePNP suicide gene system had a good killing effect on tumor cells [6-8]. According to the principle of ePNP killing tumor cells, we speculated that ePNP gene could also induce macrophage apoptosis. Therefore, this study was designed to explore the effect of ePNP suicide gene combined with fludarabine on macrophages by using macrophage-specific expression of ePNP transgenic mice. The suicide gene ePNP induced apoptosis of macrophages in transgenic mice (1) The suicide gene ePNP induced apoptosis of macrophages in transgenic mice and wild type mice (1) The ePNP transgenic mice and wild type mice were divided into two groups. The mice peritoneal macrophages were cultured in vitro with 0,0.125 ug/ml, 0.25 ug/ml, 0.5 ug/ml, 1.O ug/ml and 2.0 ug/ml precursors, respectively. CCK-8 assay showed that the survival rate of peritoneal macrophages in ePNP mice decreased significantly, especially at the concentration of 2.0 ug/ml, and the cell survival rate was only (10.8 0.8)%. (2) The survival rate of ePNP transgenic mice and wild-type mice was small. The apoptosis of peritoneal macrophages was detected by flow cytometry after intraperitoneal injection of fludarabine at doses of 0,10 mg/kg, 20 mg/kg and 60 mg/kg twice a day for five days. Fludarabine of 0,10 mg/kg, 20 mg/kg and 60 mg/kg were injected into abdominal cavity of gene mice and wild type mice twice a day for five days. The apoptosis of macrophages (lung and spleen) was detected by in situ apoptosis assay kit (TUNEL). CCK-8, flow cytometry and TUNEL showed that there was no significant macrophage apoptosis in wild-type mice. The results were statistically significant. E-/-mice were hybridized and identified as ePNP-positive mice in the F1 generation. F2 generation mice were hybridized and identified as ePNP gene and APOE-/-gene by ordinary PCR. The ePNP-positive and APOE-knockout mice in the offspring were the target mice. Conclusion The suicide gene ePNP can induce SR-A1-eP in synergy with the precursor drug fludarabine. Macrophages apoptosis in NP transgenic mice.
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R543.5

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 鄭振群;;關(guān)于巨噬細(xì)胞的幾個問題[J];山西醫(yī)藥雜志;1974年12期

2 ;豚鼠巨噬細(xì)胞經(jīng)P_(204)處理后的抗石英細(xì)胞毒作用[J];國外醫(yī)學(xué)參考資料(衛(wèi)生學(xué)分冊);1976年04期

3 鄧俠進(jìn);;巨噬細(xì)胞的抗癌作用[J];遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報;1979年02期

4 陸天才;;疾病對肺巨噬細(xì)胞的影響[J];煤礦醫(yī)學(xué);1982年01期

5 郭瑞清;祝彼得;;一種分離巨噬細(xì)胞的簡單方法[J];濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報;1990年02期

6 謝志堅;巨噬細(xì)胞異質(zhì)性[J];醫(yī)學(xué)綜述;2001年06期

7 饒艷;運動及神經(jīng)內(nèi)分泌對巨噬細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)[J];體育與科學(xué);2002年05期

8 朱金元;;吸煙對肺巨噬細(xì)胞的影響[J];浙江醫(yī)學(xué)教育;2003年01期

9 張俊峰;過氧化物酶體增殖物激活受體與單核/巨噬細(xì)胞系[J];醫(yī)學(xué)綜述;2004年03期

10 韋錦學(xué);顧軍;;巨噬細(xì)胞的激活誘導(dǎo)死亡[J];生命科學(xué);2006年02期

相關(guān)會議論文 前10條

1 史玉玲;王又明;豐美福;;巨噬細(xì)胞激活作用的研究[A];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會第五次會議論文摘要匯編[C];1992年

2 吳國明;周輝;;巨噬細(xì)胞和創(chuàng)傷纖維化[A];2009年浙江省骨科學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2009年

3 李奇;王海杰;;透明質(zhì)酸對于淋巴結(jié)巨噬細(xì)胞運動的影響[A];解剖學(xué)雜志——中國解剖學(xué)會2002年年會文摘匯編[C];2002年

4 劉革修;歐大明;劉軍花;黃紅林;廖端芳;;丙丁酚在體外能抑制巨噬細(xì)胞脂質(zhì)氧化介導(dǎo)的低密度脂蛋白氧化并調(diào)節(jié)氧化巨噬細(xì)胞的分泌功能[A];面向21世紀(jì)的科技進(jìn)步與社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展（下冊）[C];1999年

5 葉金善;楊麗霞;郭瑞威;;環(huán)氧化酶-2/前列腺素E_2在血管緊張素Ⅱ刺激巨噬細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子中的作用[A];第十三次全國心血管病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2011年

6 秦帥;陳希;孔德明;;構(gòu)建由綠色熒光標(biāo)記巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系[A];貴州省中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)分泌代謝學(xué)術(shù)會論文匯編[C];2012年

7 武劍華;徐惠綿;;腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在胃癌中的相關(guān)研究[A];第9屆全國胃癌學(xué)術(shù)會議暨第二屆陽光長城腫瘤學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2014年

8 何軍;;血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體升高巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平[A];中華醫(yī)學(xué)會第11次心血管病學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2009年

9 宋盛;周非凡;邢達(dá);;PDT誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞對巨噬細(xì)胞NO合成的影響[A];第七屆全國光生物學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2010年

10 張磊;朱建華;黃元偉;姚航平;;血管緊張素Ⅱ?qū)奘杉?xì)胞(THP-1重細(xì)胞)凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體表達(dá)的影響[A];浙江省免疫學(xué)會第五次學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2004年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 通訊員 李靜 記者 胡德榮;惡性腫瘤巨噬細(xì)胞未必皆“惡人”[N];健康報;2014年

2 蘭克;以嘗試用巨噬細(xì)胞治癱瘓[N];科技日報;2000年

3 薛佳;免疫系統(tǒng)——人體的“衛(wèi)士”[N];保健時報;2009年

4 記者 胡德榮;鐵泵蛋白“維穩(wěn)”鐵代謝作用首次闡明[N];健康報;2011年

5 侯嘉 何新鄉(xiāng);硒的神奇功能[N];中國食品質(zhì)量報;2003年

6 唐穎 倪兵 陳代杰;巨噬細(xì)胞泡沫化抑制劑研究快步進(jìn)行[N];中國醫(yī)藥報;2006年

7 劉元江;新發(fā)現(xiàn)解釋腫瘤為何易成“漏網(wǎng)之魚”[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報;2007年

8 本報記者 侯嘉 通訊員 何新鄉(xiāng);今天你補硒了嗎[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報;2003年

9 左志剛;升血小板藥使用注意[N];醫(yī)藥養(yǎng)生保健報;2007年

10 本報記者 熊江雪;“自殺基因”挑戰(zhàn)“癌王”[N];健康時報;2005年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 周赤燕;巨噬細(xì)胞MsrA對動脈粥樣硬化的干預(yù)研究[D];武漢大學(xué);2013年

2 章桂忠;TIPE2蛋白調(diào)控細(xì)胞增殖和炎癥的機制研究[D];山東大學(xué);2015年

3 張瑜;DKK1抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積及其相關(guān)分子機制[D];山東大學(xué);2015年

4 孟濤;異丙酚對心臟收縮功能的抑制作用及其對巨噬細(xì)胞分泌功能調(diào)節(jié)的機制研究[D];山東大學(xué);2015年

5 周興;基于酵母微囊構(gòu)建新型口服巨噬細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

6 蔣興偉;Tim-3對巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控機制研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2015年

7 劉伯玉;清道夫受體A介導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬鉤端螺旋體研究[D];上海交通大學(xué);2013年

8 楊紹俊;miRNA-155介導(dǎo)ESAT-6誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的分子機制及其在結(jié)核診斷中的作用[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

9 翟光耀;單核/巨噬細(xì)胞Ly6C~(low)亞群在心肌梗死后瘢痕形成期的抗炎特性研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2014年

10 韓露;TRB3介導(dǎo)的脂肪組織巨噬細(xì)胞極化與糖尿病冠狀動脈病變關(guān)系的研究[D];山東大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 于敏敏;自殺基因ePNP誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞凋亡的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2017年

2 馬春梅;AP0E~(-/-)小鼠TLR9介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化效應(yīng)對動脈粥樣硬化作用的研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

3 張譯丹;鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑調(diào)控巨噬細(xì)胞表型對實驗性矽肺的作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

4 盧文冉;HCV core蛋白作用的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清對肝細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

5 李文建;載脂蛋白E影響巨噬細(xì)胞因子表達(dá)及分型的機制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

6 曹爽;高糖對巨噬細(xì)胞TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

7 寧程程;腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在子宮內(nèi)膜癌雌激素敏感性中的作用及機制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

8 高龍;PLD4在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞抑制結(jié)腸癌增殖中的作用研究[D];成都醫(yī)學(xué)院;2015年

9 任虹;感染期子宮頸癌U14細(xì)胞荷瘤小鼠抑制巨噬細(xì)胞CCL5分泌的機制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

10 李美玲;雙酚A對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞極化影響的體外研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

，

本文編號：2212923