【摘要】：研究背景及目的血管鈣化,尤其是動脈粥樣硬化鈣化是心腦血管疾病的重要因素之一。血管鈣化是一個由多種細胞啟動并與骨發(fā)育類似的、主動的、高度可調控的、可預防和可逆轉的生物學過程。目前鈣化形成理論有骨形成蛋白調節(jié)、脂質代謝紊亂、凋亡體基質囊泡和氧化應激等多種機制,但相關的分子機制尚不完全清楚。血管鈣化主要是中層血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的鈣化。血管平滑肌細胞表達少量端粒酶(telomerase),有研究表明動脈粥樣硬化斑塊VSMCs的端粒(telomere)長度明顯短于正常血管VSMCs,端粒酶活性也明顯低,但端粒酶活性變化的調控機制及其在血管鈣化中的作用并不清楚。研究表明,NF-κB炎癥信號通路促進骨形成蛋白(bone morphogenetic protein 2,BMP2)和成骨相關轉錄因子(runt-related transcription factor 2,RUNX2)的表達,促進VSMCs 化結節(jié)形成。研究發(fā)現(xiàn)核不均一核糖蛋白A1(heterogeneous nuclear ribonucleoproteinA1,hnRNPA1)可通過結合IκBα介導其發(fā)生蛋白酶體水解,促進NF-κB入核,激活炎癥信號通路。hnRNPA1是hnRNPs家族中含量最為豐富的一類蛋白,通過調控mRNA合成過程如mRNA轉錄、剪接、穩(wěn)定性以及mRNA從胞核到胞漿轉運過程進而調控靶基因的表達。我們的前期工作發(fā)現(xiàn),在血管平滑肌細胞由收縮型向合成型轉變的過程中,人端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)和hnRNPA1的表達均顯著上調。有文獻報道hnRNPA1可以延長細胞端粒長度,防止端粒過度損耗引發(fā)的細胞早衰。因此,本研究擬闡明hnRNPA1是否可以調控血管平滑肌細胞端粒酶活性和IκBα/NF-κB信號通路從而影響血管平滑肌細胞的鈣化過程。研究方法1.分離培養(yǎng)原代人臍動脈血管平滑肌細胞(human umbilical artery smooth muscle cells,HUASMCs),構建 pcDNA3.1-hnRNP A1真核表達載體并轉染 HUASMCs,通過端粒重復擴增法(telomeric repeat amplification protocol,TRAP)、細胞增殖實驗(MTS法)與流式細胞儀分別檢測hnRNP A1對HUASMCs端粒酶活性、增殖和凋亡功能的影響。2.建立HUASMCs鈣化模型,通過實時熒光定量PCR和Western blot法檢測NF-κB信號通路調控HUASMCs鈣化相關的各基因表達,闡明hnRNP A1在血管平滑肌鈣化過程中的作用機制。研究結果1.體外培養(yǎng)HUASMCs結果表明,在HUASMCs由收縮型轉變?yōu)楹铣尚偷姆只^程中,端粒酶和hnRNP A1的表達水平均顯著上調。過表達hnRNP A1顯著上調端粒酶活性2.7倍,但對HUASMCs細胞的增殖和凋亡功能無顯著影響。2.通過建立HUASMCs鈣化模型結果表明,hnRNPA1可促進HUASMCs細胞形成鈣化結節(jié),但其促進鈣化的分子機制不是通過IκBα/NF-κB信號通路介導,具體作用機制需要進一步闡明。結論本研究發(fā)現(xiàn)端粒酶和hnRNP A1在血管平滑肌細胞由收縮型向合成型轉化的過程中表達上調,過表達hnRNP A1顯著上調端粒酶活性,促進動脈粥樣硬化過程中的血管平滑肌細胞鈣化,但具體的分子機制有待于進一步闡明。研究背景及目的動脈粥樣硬化是衰老相關的炎性疾病。單核/巨噬細胞激活是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的關鍵核心,斑塊內的巨噬細胞活動可以引起活躍的炎癥反應、纖維帽平滑肌細胞鈣化和脂質堆積等,最終導致斑塊破裂,誘發(fā)猝死、急性心肌梗死、不穩(wěn)定型心絞痛和缺血性腦卒中。研究表明,在動脈粥樣硬化形成的過程中端粒酶活性顯著上調,然而有關端粒酶激活的分子機制尚不清楚。我們在前期工作中發(fā)現(xiàn)人頸動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細胞富集區(qū)域的人端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)表達顯著上調,炎癥反應活躍。此外,我們還發(fā)現(xiàn)在體外誘導單核細胞巨噬細胞分化的過程中,hTERT表達上調的同時,一個特殊的microRNAs(miRNAs)分子,miR-216a的表達也顯著上調。已有研究提示,miR-216a在衰老內細胞中表達上調,抑制內皮細胞自噬功能,參與巨噬細胞脂質代謝,可能影響動脈粥樣硬化性心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。我們進一步的實驗研究結果提示miR-216a介導單核/巨噬細胞端粒酶激活,促進巨噬細胞激活和炎癥反應。本研究旨在探索miR-216a調控巨噬細胞端粒酶激活的分子機制,闡明其對巨噬細胞分化和功能的影響,為動脈粥樣硬化性心血管疾病的治療提供新的理論依據。研究方法1.收集頸動脈內膜剝脫術后患者的頸動脈斑塊組織,進行免疫組化與免疫熒光染色,研究斑塊中單核/巨噬細胞與hTERT的共定位情況;2.體外佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)誘導 THP1 單核細胞向巨噬細胞分化,探尋miR-216a與hTERT的表達變化,同時過表達及抑制miR-216a,研究miR-216a調控單核/巨噬細胞端粒酶激活的分子機制;3.采用ApoE-/-雄性小鼠進行右頸動脈串聯(lián)結扎術,高脂飲食,構建小鼠動脈粥樣硬化模型,研究miR-216a是否可以通過調控單核/巨噬細胞激活來影響動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展進程。研究結果1.人頸動脈粥樣硬化斑塊組織標本的免疫組化和免疫熒光染色。結果顯示與正常血管比較,hTERT在斑塊內巨噬細胞富集區(qū)域特異性表達,端粒酶活性顯著升高。2.誘導THP-1細胞向巨噬細胞轉化發(fā)現(xiàn)miR-216a與hTERT的表達均明顯升高,進一步研究表明miR-216a通過SMAD3/NF-κB信號通路調控單核/巨噬細胞端粒酶激活。3.小鼠動脈粥樣硬化模型結果顯示,miR-216a促進小鼠頸動脈單核/巨噬細胞向M1型轉化,抑制其向M2型轉化,同時miR-216a還造成小鼠斑塊中Ⅲ型膠原減少,這與斑塊的穩(wěn)定性相關。結論本研究發(fā)現(xiàn)miR-216a可以通過SMAD3/NF-κB信號通路調控單核/巨噬細胞端粒酶激活,促進巨噬細胞向M1型轉化及炎癥因子分泌,進而促進動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展進程。
[Abstract]:BACKGROUND AND OBJECTIVE Vascular calcification, especially atherosclerotic calcification, is an important factor in cardiovascular and cerebrovascular diseases. Vascular calcification is an active, highly controllable, preventable and reversible biological process initiated by a variety of cells and similar to bone development. Vascular calcification is mainly the calcification of vascular smooth muscle cells (VSMCs). Vascular smooth muscle cells (VSMCs) express a small amount of telomerase. Studies have shown that atherosclerotic plaques. The telomere length of VSMCs was significantly shorter than that of normal VSMCs, and telomerase activity was also significantly lower, but the regulatory mechanism of telomerase activity and its role in vascular calcification were not clear. The expression of related transcription factor 2 (RUNX2) promotes the formation of VSMCs nodules. It is found that heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 (hnRNPA1) can mediate the proteasome hydrolysis by binding to I kappa B alpha, promote the entry of NF-kappa B into the nucleus and activate the inflammatory signaling pathway. hnRNPA1 is the most abundant member of the hnRNPs family. A class of proteins that regulate the expression of target genes by regulating mRNA synthesis processes such as transcription, splicing, stability, and mRNA transport from nucleus to cytoplasm. Transriptase, hTERT) and hnRNPA1 expression were significantly up-regulated. It has been reported that hnRNPA1 can prolong telomere length and prevent premature senescence induced by telomere depletion. Therefore, this study is to clarify whether hnRNPA1 can regulate telomerase activity and I-kappa Balpha/NF-kappa B signaling pathway in vascular smooth muscle cells, thereby affecting vascular smooth muscle fineness. Methods 1. Human umbilical artery smooth muscle cells (HUASMCs) were isolated and cultured, and pcDNA3.1-hnRNP A1 eukaryotic expression vector was constructed and transfected into HUASMCs. The effect of hnRNP A1 on telomerase activity, proliferation and apoptosis of HUASMCs was detected by flow cytometry. 2. Calcification model of HUASMCs was established. The expression of genes related to calcification of HUASMCs was detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blot. The mechanism of hnRNP A1 in the process of vascular smooth muscle calcification was elucidated. Results 1. HUASMCs cultured in vitro showed that the expression of telomerase and hnRNP A1 were significantly up-regulated during the process of HUASMCs differentiation from contractile to synthetic. Overexpression of hnRNP A1 significantly increased telomerase activity by 2.7 times, but had no significant effect on the proliferation and apoptosis of HUASMCs. 2. Calcification model of HUASMCs was established by overexpression of hnRNP A1. The results showed that hnRNPA1 could promote the formation of calcified nodules in HUASMCs, but the molecular mechanism of hnRNPA1 was not mediated by I-kappa Balpha/NF-kappa B signaling pathway, and the specific mechanism needed to be further clarified. Overexpression of hnRNP A1 significantly up-regulates telomerase activity and promotes calcification of vascular smooth muscle cells during atherosclerosis, but the specific molecular mechanisms need to be further clarified. Macrophage activity in the heart and plaque can cause active inflammation, calcification of fibrous cap smooth muscle cells and lipid accumulation, leading to plaque rupture, sudden death, acute myocardial infarction, unstable angina and ischemic stroke. However, the molecular mechanism of telomerase activation remains unclear. In our previous work, we found that the expression of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) in the macrophage-rich region of human carotid atherosclerotic plaques was significantly up-regulated and the inflammation was active. In addition, we also found that monocytes were induced in vitro. In the process of macrophage differentiation, the expression of hTERT is up-regulated, and a special microRNAs (microRNAs) molecule, microRNAs-216a, is up-regulated. It has been suggested that microRNAs-216a may be up-regulated in aging cells, inhibit endothelial autophagy, participate in lipid metabolism of macrophages, and may affect atherosclerotic cardiovascular disease. Our further experimental results suggest that microRNA216a mediates telomerase activation in monocytes and macrophages, promotes macrophage activation and inflammation. The purpose of this study is to explore the molecular mechanism of microRNA216a regulating telomerase activation in macrophages, and to elucidate its effect on macrophage differentiation and function, which is called atherosclerosis. Methods 1. Carotid plaque tissues from patients after carotid endarterectomy were collected for immunohistochemistry and immunofluorescence staining to study the co-localization of monocyte/macrophage and hTERT in carotid plaque. 2. In vitro phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) induced THP1. Monocytes differentiate into macrophages, explore the changes of expression of microRNAs-216a and hTERT, overexpress and inhibit microRNAs-216a, and study the molecular mechanism of microRNAs regulating telomerase activation in monocytes/macrophages; 3. ApoE-/-male mice were used for right carotid artery ligation, high-fat diet, construction of atherosclerosis model, study of microRNAs-21. Results 1. Immunohistochemistry and immunofluorescence staining of human carotid atherosclerotic plaque tissue specimens. The results showed that hTERT was specifically expressed in the macrophage-rich region and telomerase activity in the plaque compared with normal blood vessels. The expression of microRNA-216a and hTERT was significantly increased in THP-1 cells induced to macrophage. Further studies showed that microRNA-216a regulated the telomerase activity of monocytes/macrophages through SMAD3/NF-kappa B signaling pathway. 3. Mice atherosclerosis model showed that microRNA-216a promoted carotid monocytes/macrophages to M1. Conclusion MicroRNA216a can regulate the telomerase activity of monocytes and macrophages through SMAD3/NF-kappa B signaling pathway, promote the transformation of macrophages to M1 and the secretion of inflammatory cytokines, thereby promoting the activation of monocytes and macrophages. The development of atherosclerotic plaque.
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R543.5

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本文編號：2178631