【摘要】：背景與目的:心肌缺氧是冠心病的關鍵病理過程,常常導致心肌細胞的損傷和調亡,進而使心肌細胞失去生理功能。近年來研究發(fā)現,mi RNA在心肌細胞凋亡中的作用及其表達異常引起了廣泛關注,mi R-206便是其中之一,它在心肌低氧應激下的表達會發(fā)生明顯變化。我們實驗室的前期研究發(fā)現,mi R-206在冠心病人循環(huán)血中的水平高于非冠心病人。然而,mi R-206在低氧誘導心肌細胞中的作用及其機制仍不清楚。因此,深入研究mi R-206在低氧誘導心肌細胞凋亡過程中的作用及其機制,將為臨床靶向延緩心肌損害提供新的視角。方法:將心肌細胞H9c2置于1%O2、94%N2、5%CO2的三氣培養(yǎng)箱內,模擬心肌缺氧;在缺氧環(huán)境下分別轉染mi R-206模擬物agomir及其陰性對照agomirNC,mi R-206抑制劑antagomir及其陰性對照antagomir-NC;MTT法檢測干擾后低氧環(huán)境下各組心肌細胞活力;Annexin V/PI雙標法流式細胞術檢測干擾后低氧環(huán)境下各組心肌細胞凋亡率;q RT-PCR法檢測干擾后低氧環(huán)境下各組mi R-206的靶基因EGFR、HIF-1α和IGF-1的m RNA水平變化;Western Blot檢測干擾后低氧環(huán)境下各組EGFR、HIF-1α和IGF-1蛋白表達水平變化。雙熒光素酶報告基因法驗證mi R-206與其靶基因EGFR和HIF-1α的m RNA 3’UTR的結合。結果:MTT法檢測顯示agomir組較agomir-NC組細胞活力增高,而antagomir組較antagomir-NC組細胞活力下降;流式細胞術檢測顯示agomir組較agomirNC組細胞凋亡率降低,而antagomir組較antagomir-NC組細胞凋亡率升高;q RT-PCR法檢測發(fā)現干擾后各組EGFR、HIF-1α和IGF-1的m RNA水平無變化,但Western Blot結果顯示agomir組較agomir-NC組EGFR和HIF-1α蛋白表達水平降低,而antagomir組較antagomir-NC組EGFR和HIF-1α蛋白表達水平升高。雙熒光素酶報告基因檢測顯示mi R-206可以直接與EGFR和HIF-1α的m RNA 3’UTR結合。結論:Micro RNA-206在低氧誘導的心肌細胞損傷和凋亡過程中,發(fā)揮了保護心肌細胞的作用。這種抗損傷和凋亡的作用正是通過轉錄后水平負性調控EGFR和HIF-1α的表達發(fā)揮作用,這為延緩心肌損害提供了一個新的潛在的藥物作用靶點。
[Abstract]:Background & AIM: myocardial hypoxia is a key pathological process of coronary heart disease. In recent years, it has been found that the role and abnormal expression of TMI RNA in cardiomyocyte apoptosis is one of them, and its expression will change obviously under hypoxic stress. Our previous laboratory study found that MMI R-206 levels in circulating blood were higher in patients with coronary heart disease than in patients with non-coronary heart disease. However, the role of MMI R-206 in hypoxia-induced cardiomyocytes and its mechanism remain unclear. Therefore, the further study of the role and mechanism of mi R-206 in hypoxia induced cardiomyocyte apoptosis will provide a new perspective for clinical targeted delay of myocardial damage. Methods: the cardiomyocytes H9c2 were placed in the three-air incubator of 1O _ 2, N _ 2 and N _ 2O _ 2 to simulate myocardial anoxia. Transfection of miR-206 analogue agomir and agomir-NCncncnmc-mi R-206 inhibitor antagomir in anoxic environment and antagomir-NCX assay in negative control group for detecting myocardial viability in hypoxic environment after interference and flow cytometry with Annexin V / Pi double labeled flow cytometry to detect the low level of myocardial cell viability after interference Apoptosis rate of cardiomyocytes in each group was determined by Q RT-PCR after hypoxia. The mRNA levels of EGFR- HIF-1 偽 and IGF-1 mRNA were detected by Western blot. The expression levels of HIF-1 偽 and IGF-1 protein were detected by Western blot. The binding of mi R-206 to its target genes EGFR and HIF-1 偽 was confirmed by double luciferase reporter gene method. Results the cell viability of agomir group was higher than that of agomir-NC group, while that of antagomir group was lower than that of antagomir-NC group, and the apoptosis rate of agomir group was lower than that of agomirNC group by flow cytometry. The expression of EGFR and HIF-1 偽 in antagomir group was lower than that in agomir-NC group, but the mRNA levels of HIF-1 偽 and IGF-1 in agomir group were lower than those in agomir-NC group. The expression of EGFR and HIF-1 偽 in antagomir group was higher than that in antagomir-NC group. The detection of double luciferase reporter gene showed that mi R-206 could directly bind to EGFR and HIF-1 偽 mRNA 3UTR. Conclusion\%\ This action of anti-injury and apoptosis is played by the negative regulation of EGFR and HIF-1 偽 expression at post-transcriptional level, which provides a new potential drug target for delaying myocardial injury.
【學位授予單位】：寧波大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R54

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本文編號：2130753