【摘要】：研究背景鈣化性主動(dòng)脈瓣疾病是老年人常見的心血管疾病。在發(fā)達(dá)國家,三分之一的60歲以上老年人行心臟超聲或放射線檢查提示有主動(dòng)脈瓣鈣化的證據(jù),其中10%的人診斷為鈣化性主動(dòng)脈瓣疾病。在我國研究發(fā)現(xiàn)45歲以上患者鈣化性主動(dòng)脈瓣疾病總體患病率為12.8%。隨著全球人口的增長和老齡化的趨勢,鈣化性主動(dòng)脈瓣疾病將會(huì)越來越多。目前沒有明確的藥物可以延緩和阻止主動(dòng)脈瓣鈣化的進(jìn)展,重度主動(dòng)脈瓣狹窄只能行外科手術(shù)或經(jīng)皮介入手術(shù)進(jìn)行換瓣治療�；颊咭坏┌l(fā)展為重度主動(dòng)脈瓣狹窄,出現(xiàn)癥狀后生存時(shí)間明顯縮短,威脅患者生命,給家庭和社會(huì)帶來沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。目前主動(dòng)脈瓣鈣化的病理生理機(jī)制尚不明確,需要全面和深入的研究來揭示其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為主動(dòng)脈瓣鈣化是與年齡老化相關(guān)的退行性改變,但是越來越多的研究證實(shí)主動(dòng)脈瓣鈣化的發(fā)生發(fā)展是積極主動(dòng)并受嚴(yán)密調(diào)控的病理生理過程,包括炎癥,脂質(zhì)聚集,基質(zhì)重構(gòu)以及骨化鈣化等多種分子機(jī)制。大量的研究證實(shí)炎癥在主動(dòng)脈瓣鈣化過程中起重要作用,表明鈣化性主動(dòng)脈瓣疾病是一種慢性炎癥疾病。已有研究發(fā)現(xiàn)某些引起口腔感染的細(xì)菌物質(zhì)存在于鈣化病變瓣膜上,而且在實(shí)驗(yàn)兔子體內(nèi)接種這種細(xì)菌可以誘導(dǎo)出主動(dòng)脈瓣病變,提示感染炎癥可能是主動(dòng)脈瓣鈣化的重要機(jī)制。除了細(xì)菌感染外,還有常見的病毒感染,在動(dòng)脈粥樣硬化的研究中發(fā)現(xiàn)很多病毒感染如皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒等可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。鈣化性主動(dòng)脈瓣疾病與動(dòng)脈粥樣硬化在病理變化和發(fā)病機(jī)制方面有些相似,但是目前關(guān)于病毒感染與主動(dòng)脈瓣鈣化病變的相關(guān)研究很少。病毒在復(fù)制過程中可產(chǎn)生雙鏈核糖核酸(dsRNA)即外源性dsRNA,它能被體內(nèi)的模式識(shí)別受體識(shí)別,激活免疫細(xì)胞,誘導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng),發(fā)揮抗病毒作用。細(xì)胞的基因在復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中也可以產(chǎn)生核酸分子,在細(xì)胞破壞或死亡時(shí)釋放產(chǎn)生的dsRNA稱為內(nèi)源性dsRNA。近來研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外的核酸分子包括dsRNA作為內(nèi)源性物質(zhì)參與免疫炎癥反應(yīng),與心肌缺血再灌注損傷、腎功能衰竭、糖尿病、自身免疫性疾病和神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病密切相關(guān)。目前外源性或內(nèi)源性核酸分子dsRNA在主動(dòng)脈瓣鈣化病變發(fā)生發(fā)展過程中的作用尚未可知。病毒性dsRNA和內(nèi)源性dsRNA均主要由Toll樣受體3(TLR3)來識(shí)別。Toll樣受體(TLRs)是一類識(shí)別病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式的重要受體家族,在宿主防御外來微生物危害和組織損傷方面起重要作用。TLR3分布在免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞的細(xì)胞膜或內(nèi)涵體膜上,TLR3識(shí)別外源性或內(nèi)源性dsRNA后,募集轉(zhuǎn)接分子β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域連接蛋白(TRIF),進(jìn)而激活下游的干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-1κB)以及絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)等信號(hào)通路,將信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)促進(jìn)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá),參與人體生理功能及疾病的病理生理過程。主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞是主動(dòng)脈瓣的主要細(xì)胞成分,在鈣化性主動(dòng)脈瓣狹窄的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。致動(dòng)脈粥樣硬化因子和機(jī)械力可以刺激主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子,生長因子,基質(zhì)蛋白和骨化介質(zhì)。我們既往的研究發(fā)現(xiàn)刺激主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞上的TLR2/4能產(chǎn)生炎癥反應(yīng)并使間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌晒羌?xì)胞表型。但是TLR3及其配基dsRNA對人主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的影響及作用機(jī)制尚不清楚。聚肌苷酸-聚胞啶酸[poly(I:C)]是dsRNA的類似物,廣泛用于體內(nèi)體外研究,一些研究發(fā)現(xiàn)poly(I:C)能刺激炎癥細(xì)胞活化產(chǎn)生細(xì)胞因子,能刺激間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。因此本研究選用了 poly(I:C)作為dsRNA類似物刺激人主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞,觀察炎癥介質(zhì)和骨化因子在間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá),以及細(xì)胞內(nèi)鈣沉積和鈣結(jié)節(jié)的形成,并探討了其中可能的分子信號(hào)機(jī)制,為鈣化性主動(dòng)脈瓣疾病的潛在防治靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。目的本研究的目的是探討dsRNA和TLR3誘導(dǎo)人主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞炎癥、骨化反應(yīng),促進(jìn)鈣結(jié)節(jié)形成,以及這些作用發(fā)生的可能分子信號(hào)機(jī)制。方法1.從正常的人主動(dòng)脈瓣膜組織中分離出瓣膜間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),細(xì)胞傳代至4-6代用于研究。將細(xì)胞傳代至6孔或24孔細(xì)胞培養(yǎng)板以及玻片上,等長至覆蓋培養(yǎng)孔80%-90%時(shí)處理細(xì)胞。2.Poly(I:C)處理細(xì)胞2小時(shí)至24小時(shí),應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中單核細(xì)胞趨化因子(MCP-1)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)和白介素-1β(IL-1β)的濃度;應(yīng)用免疫印跡方法(western immunoblotting)測定細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、骨成型蛋白-2(BMP-2)、堿性磷酸酶(ALp)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)蛋白表達(dá)量。3.延長poly(I:C)處理細(xì)胞時(shí)間至2周,應(yīng)用ALP活性染色檢測細(xì)胞ALP的活性,應(yīng)用茜素紅S(Alizarin redS)染色,檢測細(xì)胞鈣沉積。4.Poly(I：C)處理細(xì)胞30分鐘至24小時(shí),應(yīng)用免疫印跡方法測定NF-κB p65和ERK1/2磷酸化水平。5.應(yīng)用基因沉默的方法,予TLR3 siRNA或TRIF siRNA預(yù)處理細(xì)胞72小時(shí)。Poly(I:C)處理細(xì)胞24小時(shí),應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定MCP-1、IL-6和IL-8濃度;應(yīng)用免疫印跡方法分析TLR3、TRIF、ICAM-1、BMP-2、ALP和TGF-β1蛋白表達(dá)量。Poly(I:C)處理細(xì)胞2小時(shí)至8小時(shí),分析NF-κBp65、ERK1/2磷酸化水平的變化。6.應(yīng)用 IKK 抑制劑(Bay11-7082)或 ERK1/2 抑制劑(328000ERK)處理細(xì)胞1小時(shí)后,再予poly(I:C)處理細(xì)胞24小時(shí),應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定MCP-1、IL-6和IL-8濃度;應(yīng)用免疫印跡方法分析ICAM-1、BMP-2、ALP和TGF-β1蛋白表達(dá)量。7.應(yīng)用NF-κB p50遷移抑制劑SN50預(yù)處理細(xì)胞1小時(shí)。Poly(I:C)處理細(xì)胞24小時(shí),應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定MCP-1、IL-6和IL-8濃度;應(yīng)用免疫印跡方法分析ICAM-1蛋白表達(dá)量。內(nèi)毒素(LPS)處理細(xì)胞24小時(shí),應(yīng)用免疫印跡方法分析ICAM-1蛋白表達(dá)量。8.Poly(I:C)或LPS處理細(xì)胞30分鐘到24小時(shí),應(yīng)用免疫印跡方法測定NF-κB p50蛋白表達(dá)。Poly(I:C)或LPS分別處理細(xì)胞1小時(shí)和2小時(shí),應(yīng)用免疫共沉淀方法測定NF-κB p65/p50異二聚體表達(dá)。9.SN50預(yù)處理細(xì)胞1小時(shí),再予poly(I：C)或LPS處理細(xì)胞1小時(shí)和2小時(shí),應(yīng)用免疫熒光染色的方法檢測p50和p65亞基在細(xì)胞核內(nèi)聚集情況。結(jié)果1.Poly(I:C)(0.5-10μg/mL)能刺激人主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)ICAM-1、BMP-2、ALP和TGF-β1增多,并呈劑量反應(yīng)性。2.5μg/mLpoly(I:C)誘導(dǎo)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)ICAM-1、BMP-2、TGF-β1和ALP蛋白分別增加約11倍、2.4倍、2.1倍和1.8倍,與未處理對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Poly(I:C)能刺激間質(zhì)細(xì)胞分泌MCP-1、IL-6和IL-8明顯增多:IL-6(134.279±19.661pg/mL VS 668.317±71.411 pg/mL),IL-8(10.198士6.363 pg/mL VS 1345.647±339.309 pg/mL),MCP-1(254.893士58.556 pg/mL VS 782.355±123.391pg/mL),與未處理對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.Poly(I：C)處理后IL-1β濃度無明顯增加,與未處理的對照組相比,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而且poly(I:C)刺激后細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-1β濃度很低,低于 31pg/mL。3.人主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞給予poly(I:C)處理2周后細(xì)胞ALP活性明顯增加,細(xì)胞鈣沉積增多并形成鈣結(jié)節(jié)。半定量鈣染色結(jié)果顯示poly(I:C)刺激使鈣沉積與未處理對照組比較增加約4.5倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.Poly(I:C)能快速和較持久的刺激NF-κBp65、ERK1/2磷酸化。poly(I：C)刺激后,NF-κB p65磷酸化在1小時(shí)開始增加,2小時(shí)達(dá)到高峰,4小時(shí)后仍存在,與未處理對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);ERK1/2磷酸化在30分鐘就開始增加,2小時(shí)達(dá)到高峰,8小時(shí)仍明顯活化,與未處理對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.應(yīng)用基因沉默的方法能明顯降低TLR3和TRIF蛋白表達(dá),TLR3 siRNA降低TLR3蛋白表達(dá)量約60%,TRIF siRNA使TRIF蛋白表達(dá)幾乎完全抑制,siRNA處理組與未處理對照組、單用poly(I:C)組、poly(I:C)+scrambled siRNA組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。阻斷TLR3作用后,poly(I:C)刺激NF-κB p65和ERK1/2磷酸化作用明顯減弱,與單用poly(I:C)組比降低了約2倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與未處理對照組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。阻斷TRIF作用后,poly(I:C)刺激NF-κB p65和ERK1/2磷酸化作用顯著減弱,與單用poly(I:C)組比降低了約4倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與未處理對照組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。阻斷TLR3和TRIF后,poly(I:C)刺激ICAM-1、BMP-2、ALP和TGF-β1表達(dá)以及MCP-1、IL-6和IL-8分泌的作用被明顯阻斷,與單用poly(I:C)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。ICAM-1、BMP-2、ALP、TGF-β1表達(dá)量和IL-6、MCP-1濃度與未處理對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。阻斷TLR3后IL-8濃度仍高于未處理對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(489.453±65.207 pg/mL VS 148.021±52.088 pg/mL,P=0.024),阻斷 TRIF 后 IL-8濃度與未處理對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6.IKK 抑制劑 Bay11-7082 能顯著抑制 poly(I:C)刺激的 ICAM-1、BMP-2、ALP 和 TGF-β1 表達(dá)及 MCP-1、IL-6 和 IL-8 分泌。ICAM-1、BMP-2、ALP、TGF-β1表達(dá)量和MCP-1、IL-6和IL-8濃度顯著降低,與單用poly(I:C)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與未處理對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。7.ERK1/2 抑制劑 328000ERK 不能抑制 poly(I:C)刺激的 ICAM-1、MCP-1、IL-6和IL-8炎癥因子表達(dá),ICAM-1表達(dá)量及MCP-1、IL-6和IL-8濃度與單用poly(I:C)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。ERK1/2抑制劑能明顯抑制poly(I:C)刺激的BMP-2、ALP和TGF-β1骨化因子表達(dá),BMP-2、ALP和TGF-β1蛋白表達(dá)量明顯降低,與單用poly(I:C)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與未處理對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。8.NF-κB p50遷移抑制劑SN50不能抑制poly(I:C)刺激的ICAM-1、MCP-1、IL-6和IL-8表達(dá),IL-6和IL-8濃度輕度升高,與單用poly(I:C)組比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。ICAM-1表達(dá)反而增加1.7倍,MCP-1濃度也明顯增加:(1702.690±135.736pg/mLVS 1226.033±76.326pg/mL),與單用 poly(I:C)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。SN50明顯抑制LPS刺激的ICAM-1表達(dá),ICAM-1表達(dá)量顯著降低,與單用LPS比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與未處理對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。9.NF-κB p50亞基和p65/p50異二聚體在人主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)明顯,poly(I:C)處理與LPS處理比較,兩者間無明顯差異。免疫熒光染色顯示poly(I:C)或LPS刺激間質(zhì)細(xì)胞1小時(shí)和2小時(shí)后,NF-κB p50和p65亞基明顯在細(xì)胞核內(nèi)聚集,SN50能明顯抑制poly(I:C)或LPS誘導(dǎo)的p50亞基在細(xì)胞核內(nèi)聚集,能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的p65亞基核內(nèi)聚集,但不能抑制poly(I:C)誘導(dǎo)的p65亞基核內(nèi)聚集。結(jié)論1.雙鏈核糖核酸刺激人主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)和分泌炎癥介質(zhì):細(xì)胞間黏附分子-1、白介素-6、白介素-8、單核細(xì)胞趨化因子-1和骨化因子:骨形成蛋白-2、堿性磷酸酶和轉(zhuǎn)化生長因子-β1。較長時(shí)間的刺激能增加瓣膜間質(zhì)細(xì)胞堿性磷酸酶的活性,促進(jìn)鈣沉積并形成鈣結(jié)節(jié)。2.雙鏈核糖核酸刺激人主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用由TLR3-TRIF-NF-KB信號(hào)通路介導(dǎo),刺激瓣膜間質(zhì)細(xì)胞骨化反應(yīng)的作用由TLR3-TRIF-NF-KB 和 ERK1/2 信號(hào)通路介導(dǎo)。3.雙鏈核糖核酸不能激活人主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥體。4.Toll樣受體3激活的核因子κB復(fù)合物不是經(jīng)典的p65/p50異二聚體復(fù)合物。在本研究中我們揭示了 dsRNA激活TLR3能誘導(dǎo)人主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生多種炎癥因子和骨化介質(zhì),形成鈣結(jié)節(jié),并探討了這些作用的分子機(jī)制,提示TLR3介導(dǎo)人主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞炎癥和骨化反應(yīng)參與鈣化性主動(dòng)脈瓣膜病變的發(fā)生發(fā)展。深入認(rèn)識(shí)TLR3這一內(nèi)在免疫受體在瓣膜鈣化病變中的作用機(jī)制,可能有助于鈣化性主動(dòng)脈瓣疾病藥物治療的研究進(jìn)展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R542.5

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本文編號(hào)：2121438