【摘要】：研究背景鈣化性主動脈瓣疾病是老年人常見的心血管疾病。在發(fā)達國家,三分之一的60歲以上老年人行心臟超聲或放射線檢查提示有主動脈瓣鈣化的證據(jù),其中10%的人診斷為鈣化性主動脈瓣疾病。在我國研究發(fā)現(xiàn)45歲以上患者鈣化性主動脈瓣疾病總體患病率為12.8%。隨著全球人口的增長和老齡化的趨勢,鈣化性主動脈瓣疾病將會越來越多。目前沒有明確的藥物可以延緩和阻止主動脈瓣鈣化的進展,重度主動脈瓣狹窄只能行外科手術或經皮介入手術進行換瓣治療�；颊咭坏┌l(fā)展為重度主動脈瓣狹窄,出現(xiàn)癥狀后生存時間明顯縮短,威脅患者生命,給家庭和社會帶來沉重的醫(yī)療負擔。目前主動脈瓣鈣化的病理生理機制尚不明確,需要全面和深入的研究來揭示其發(fā)生發(fā)展的機制。傳統(tǒng)觀念認為主動脈瓣鈣化是與年齡老化相關的退行性改變,但是越來越多的研究證實主動脈瓣鈣化的發(fā)生發(fā)展是積極主動并受嚴密調控的病理生理過程,包括炎癥,脂質聚集,基質重構以及骨化鈣化等多種分子機制。大量的研究證實炎癥在主動脈瓣鈣化過程中起重要作用,表明鈣化性主動脈瓣疾病是一種慢性炎癥疾病。已有研究發(fā)現(xiàn)某些引起口腔感染的細菌物質存在于鈣化病變瓣膜上,而且在實驗兔子體內接種這種細菌可以誘導出主動脈瓣病變,提示感染炎癥可能是主動脈瓣鈣化的重要機制。除了細菌感染外,還有常見的病毒感染,在動脈粥樣硬化的研究中發(fā)現(xiàn)很多病毒感染如皰疹病毒、巨細胞病毒、EB病毒等可促進動脈粥樣硬化的發(fā)生。鈣化性主動脈瓣疾病與動脈粥樣硬化在病理變化和發(fā)病機制方面有些相似,但是目前關于病毒感染與主動脈瓣鈣化病變的相關研究很少。病毒在復制過程中可產生雙鏈核糖核酸(dsRNA)即外源性dsRNA,它能被體內的模式識別受體識別,激活免疫細胞,誘導免疫炎癥反應,發(fā)揮抗病毒作用。細胞的基因在復制和轉錄過程中也可以產生核酸分子,在細胞破壞或死亡時釋放產生的dsRNA稱為內源性dsRNA。近來研究發(fā)現(xiàn)細胞外的核酸分子包括dsRNA作為內源性物質參與免疫炎癥反應,與心肌缺血再灌注損傷、腎功能衰竭、糖尿病、自身免疫性疾病和神經系統(tǒng)退行性疾病密切相關。目前外源性或內源性核酸分子dsRNA在主動脈瓣鈣化病變發(fā)生發(fā)展過程中的作用尚未可知。病毒性dsRNA和內源性dsRNA均主要由Toll樣受體3(TLR3)來識別。Toll樣受體(TLRs)是一類識別病原相關分子模式和損傷相關分子模式的重要受體家族,在宿主防御外來微生物危害和組織損傷方面起重要作用。TLR3分布在免疫細胞和非免疫細胞的細胞膜或內涵體膜上,TLR3識別外源性或內源性dsRNA后,募集轉接分子β干擾素TIR結構域連接蛋白(TRIF),進而激活下游的干擾素調節(jié)因子3(IRF3)、核轉錄因子κB(NF-1κB)以及絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)等信號通路,將信號傳導至細胞核內促進相關基因轉錄和蛋白質表達,參與人體生理功能及疾病的病理生理過程。主動脈瓣膜間質細胞是主動脈瓣的主要細胞成分,在鈣化性主動脈瓣狹窄的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。致動脈粥樣硬化因子和機械力可以刺激主動脈瓣膜間質細胞表達細胞因子,生長因子,基質蛋白和骨化介質。我們既往的研究發(fā)現(xiàn)刺激主動脈瓣膜間質細胞上的TLR2/4能產生炎癥反應并使間質細胞轉變?yōu)槌晒羌毎硇�。但是TLR3及其配基dsRNA對人主動脈瓣膜間質細胞的影響及作用機制尚不清楚。聚肌苷酸-聚胞啶酸[poly(I:C)]是dsRNA的類似物,廣泛用于體內體外研究,一些研究發(fā)現(xiàn)poly(I:C)能刺激炎癥細胞活化產生細胞因子,能刺激間充質干細胞向成骨細胞分化。因此本研究選用了 poly(I:C)作為dsRNA類似物刺激人主動脈瓣膜間質細胞,觀察炎癥介質和骨化因子在間質細胞的表達,以及細胞內鈣沉積和鈣結節(jié)的形成,并探討了其中可能的分子信號機制,為鈣化性主動脈瓣疾病的潛在防治靶點提供理論依據(jù)。目的本研究的目的是探討dsRNA和TLR3誘導人主動脈瓣膜間質細胞炎癥、骨化反應,促進鈣結節(jié)形成,以及這些作用發(fā)生的可能分子信號機制。方法1.從正常的人主動脈瓣膜組織中分離出瓣膜間質細胞進行培養(yǎng),細胞傳代至4-6代用于研究。將細胞傳代至6孔或24孔細胞培養(yǎng)板以及玻片上,等長至覆蓋培養(yǎng)孔80%-90%時處理細胞。2.Poly(I:C)處理細胞2小時至24小時,應用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定細胞培養(yǎng)上清液中單核細胞趨化因子(MCP-1)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)和白介素-1β(IL-1β)的濃度;應用免疫印跡方法(western immunoblotting)測定細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、骨成型蛋白-2(BMP-2)、堿性磷酸酶(ALp)和轉化生長因子-β1(TGF-β1)蛋白表達量。3.延長poly(I:C)處理細胞時間至2周,應用ALP活性染色檢測細胞ALP的活性,應用茜素紅S(Alizarin redS)染色,檢測細胞鈣沉積。4.Poly(I：C)處理細胞30分鐘至24小時,應用免疫印跡方法測定NF-κB p65和ERK1/2磷酸化水平。5.應用基因沉默的方法,予TLR3 siRNA或TRIF siRNA預處理細胞72小時。Poly(I:C)處理細胞24小時,應用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定MCP-1、IL-6和IL-8濃度;應用免疫印跡方法分析TLR3、TRIF、ICAM-1、BMP-2、ALP和TGF-β1蛋白表達量。Poly(I:C)處理細胞2小時至8小時,分析NF-κBp65、ERK1/2磷酸化水平的變化。6.應用 IKK 抑制劑(Bay11-7082)或 ERK1/2 抑制劑(328000ERK)處理細胞1小時后,再予poly(I:C)處理細胞24小時,應用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定MCP-1、IL-6和IL-8濃度;應用免疫印跡方法分析ICAM-1、BMP-2、ALP和TGF-β1蛋白表達量。7.應用NF-κB p50遷移抑制劑SN50預處理細胞1小時。Poly(I:C)處理細胞24小時,應用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定MCP-1、IL-6和IL-8濃度;應用免疫印跡方法分析ICAM-1蛋白表達量。內毒素(LPS)處理細胞24小時,應用免疫印跡方法分析ICAM-1蛋白表達量。8.Poly(I:C)或LPS處理細胞30分鐘到24小時,應用免疫印跡方法測定NF-κB p50蛋白表達。Poly(I:C)或LPS分別處理細胞1小時和2小時,應用免疫共沉淀方法測定NF-κB p65/p50異二聚體表達。9.SN50預處理細胞1小時,再予poly(I：C)或LPS處理細胞1小時和2小時,應用免疫熒光染色的方法檢測p50和p65亞基在細胞核內聚集情況。結果1.Poly(I:C)(0.5-10μg/mL)能刺激人主動脈瓣膜間質細胞表達ICAM-1、BMP-2、ALP和TGF-β1增多,并呈劑量反應性。2.5μg/mLpoly(I:C)誘導瓣膜間質細胞表達ICAM-1、BMP-2、TGF-β1和ALP蛋白分別增加約11倍、2.4倍、2.1倍和1.8倍,與未處理對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Poly(I:C)能刺激間質細胞分泌MCP-1、IL-6和IL-8明顯增多:IL-6(134.279±19.661pg/mL VS 668.317±71.411 pg/mL),IL-8(10.198士6.363 pg/mL VS 1345.647±339.309 pg/mL),MCP-1(254.893士58.556 pg/mL VS 782.355±123.391pg/mL),與未處理對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.Poly(I：C)處理后IL-1β濃度無明顯增加,與未處理的對照組相比,差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05),而且poly(I:C)刺激后細胞培養(yǎng)上清中的IL-1β濃度很低,低于 31pg/mL。3.人主動脈瓣膜間質細胞給予poly(I:C)處理2周后細胞ALP活性明顯增加,細胞鈣沉積增多并形成鈣結節(jié)。半定量鈣染色結果顯示poly(I:C)刺激使鈣沉積與未處理對照組比較增加約4.5倍,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.Poly(I:C)能快速和較持久的刺激NF-κBp65、ERK1/2磷酸化。poly(I：C)刺激后,NF-κB p65磷酸化在1小時開始增加,2小時達到高峰,4小時后仍存在,與未處理對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05);ERK1/2磷酸化在30分鐘就開始增加,2小時達到高峰,8小時仍明顯活化,與未處理對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.應用基因沉默的方法能明顯降低TLR3和TRIF蛋白表達,TLR3 siRNA降低TLR3蛋白表達量約60%,TRIF siRNA使TRIF蛋白表達幾乎完全抑制,siRNA處理組與未處理對照組、單用poly(I:C)組、poly(I:C)+scrambled siRNA組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。阻斷TLR3作用后,poly(I:C)刺激NF-κB p65和ERK1/2磷酸化作用明顯減弱,與單用poly(I:C)組比降低了約2倍,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),與未處理對照組比差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。阻斷TRIF作用后,poly(I:C)刺激NF-κB p65和ERK1/2磷酸化作用顯著減弱,與單用poly(I:C)組比降低了約4倍,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),與未處理對照組比差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。阻斷TLR3和TRIF后,poly(I:C)刺激ICAM-1、BMP-2、ALP和TGF-β1表達以及MCP-1、IL-6和IL-8分泌的作用被明顯阻斷,與單用poly(I:C)組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。ICAM-1、BMP-2、ALP、TGF-β1表達量和IL-6、MCP-1濃度與未處理對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。阻斷TLR3后IL-8濃度仍高于未處理對照組,差異有統(tǒng)計學意義(489.453±65.207 pg/mL VS 148.021±52.088 pg/mL,P=0.024),阻斷 TRIF 后 IL-8濃度與未處理對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。6.IKK 抑制劑 Bay11-7082 能顯著抑制 poly(I:C)刺激的 ICAM-1、BMP-2、ALP 和 TGF-β1 表達及 MCP-1、IL-6 和 IL-8 分泌。ICAM-1、BMP-2、ALP、TGF-β1表達量和MCP-1、IL-6和IL-8濃度顯著降低,與單用poly(I:C)組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),與未處理對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。7.ERK1/2 抑制劑 328000ERK 不能抑制 poly(I:C)刺激的 ICAM-1、MCP-1、IL-6和IL-8炎癥因子表達,ICAM-1表達量及MCP-1、IL-6和IL-8濃度與單用poly(I:C)組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。ERK1/2抑制劑能明顯抑制poly(I:C)刺激的BMP-2、ALP和TGF-β1骨化因子表達,BMP-2、ALP和TGF-β1蛋白表達量明顯降低,與單用poly(I:C)組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),與未處理對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。8.NF-κB p50遷移抑制劑SN50不能抑制poly(I:C)刺激的ICAM-1、MCP-1、IL-6和IL-8表達,IL-6和IL-8濃度輕度升高,與單用poly(I:C)組比較差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)。ICAM-1表達反而增加1.7倍,MCP-1濃度也明顯增加:(1702.690±135.736pg/mLVS 1226.033±76.326pg/mL),與單用 poly(I:C)比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。SN50明顯抑制LPS刺激的ICAM-1表達,ICAM-1表達量顯著降低,與單用LPS比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),與未處理對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。9.NF-κB p50亞基和p65/p50異二聚體在人主動脈瓣間質細胞表達明顯,poly(I:C)處理與LPS處理比較,兩者間無明顯差異。免疫熒光染色顯示poly(I:C)或LPS刺激間質細胞1小時和2小時后,NF-κB p50和p65亞基明顯在細胞核內聚集,SN50能明顯抑制poly(I:C)或LPS誘導的p50亞基在細胞核內聚集,能明顯抑制LPS誘導的p65亞基核內聚集,但不能抑制poly(I:C)誘導的p65亞基核內聚集。結論1.雙鏈核糖核酸刺激人主動脈瓣膜間質細胞表達和分泌炎癥介質:細胞間黏附分子-1、白介素-6、白介素-8、單核細胞趨化因子-1和骨化因子:骨形成蛋白-2、堿性磷酸酶和轉化生長因子-β1。較長時間的刺激能增加瓣膜間質細胞堿性磷酸酶的活性,促進鈣沉積并形成鈣結節(jié)。2.雙鏈核糖核酸刺激人主動脈瓣膜間質細胞炎癥反應的作用由TLR3-TRIF-NF-KB信號通路介導,刺激瓣膜間質細胞骨化反應的作用由TLR3-TRIF-NF-KB 和 ERK1/2 信號通路介導。3.雙鏈核糖核酸不能激活人主動脈瓣膜間質細胞NLRP3炎癥體。4.Toll樣受體3激活的核因子κB復合物不是經典的p65/p50異二聚體復合物。在本研究中我們揭示了 dsRNA激活TLR3能誘導人主動脈瓣膜間質細胞產生多種炎癥因子和骨化介質,形成鈣結節(jié),并探討了這些作用的分子機制,提示TLR3介導人主動脈瓣膜間質細胞炎癥和骨化反應參與鈣化性主動脈瓣膜病變的發(fā)生發(fā)展。深入認識TLR3這一內在免疫受體在瓣膜鈣化病變中的作用機制,可能有助于鈣化性主動脈瓣疾病藥物治療的研究進展。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R542.5

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本文編號：2121438