本文選題：糖基化終末產(chǎn)物 + 胰高血糖素樣肽-1�。� 參考：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：背景全球2型糖尿病人群日益增多,已成為世界范圍性的健康問題和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。糖尿病對人類的危害主要在于各種并發(fā)癥帶來的傷殘,而以大血管和微血管病變?yōu)橹鞯穆圆l(fā)癥帶來的危害最大。在糖尿病血管病變發(fā)展過程中,糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs)的加速形成及其在血管組織中的大量聚集發(fā)揮著重要作用. AGEs不僅通過與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián),改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能,影響脂質(zhì)代謝并修飾核酸直接影響細(xì)胞和組織的功能,而且也可與組織細(xì)胞表面AGEs的特異性受體結(jié)合,激動細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,導(dǎo)致血管疾病發(fā)生、發(fā)展。血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管腔面的一層半選擇性通透屏障,血液和組織中物質(zhì)交換必須通過血管內(nèi)皮細(xì)胞層選擇性的進(jìn)行,因此維持其形態(tài)完整和功能正常至關(guān)重要。AGEs蓄積、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等因素導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是糖尿病大血管病變的始動環(huán)節(jié),隨之而來的是血管內(nèi)皮屏障功能受損,表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞收縮性增加和細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)破壞,內(nèi)皮通透性增加,其中細(xì)胞收縮主要和肌球蛋白輕鏈(myosin light chain, MLC)磷酸化介導(dǎo)的細(xì)胞骨架重排密切相關(guān)。胰高血糖素樣肽-1(glucagon like peptide-1, GLP-1)是腸道L細(xì)胞分泌的一種多肽類激素,除調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)外,在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著潛在的生物學(xué)功能。研究報道GLP-1可以通過抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等從而對血管內(nèi)皮舒張功能發(fā)揮保護(hù)作用,然而GLP-1對糖尿病血管內(nèi)皮屏障功能是否產(chǎn)生影響,機(jī)制如何,目前少見報道。目的在整體水平研究GLP-1對2型糖尿病大鼠胸主動脈內(nèi)膜通透性的影響,以及動脈壁MLC及上游RAGE/Rho/ROCK信號通路是否為GLP-1作用靶點。在細(xì)胞水平探明GLP-1對AGEs孵育的血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的影響及其與MLC磷酸化相關(guān)的分子機(jī)制。方法1.采用高脂飲食結(jié)合小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射復(fù)制2型糖尿病大鼠模型,給予西格列汀(10mg/kg/d和30mg/kg/d)干預(yù)12周。酶法、放免法和Elisa法檢測血清學(xué)指標(biāo),電鏡和HE染色進(jìn)行主動脈形態(tài)學(xué)觀察,離體動脈環(huán)實驗檢測動脈內(nèi)皮舒張功能,大分子熒光染料滲透法檢測動脈內(nèi)膜通透性,免疫組織化學(xué)法和Western blot法檢測GLP-1R、RAGE、ROCK、MYPT、MLCK和MLC蛋白的表達(dá)和磷酸化水平變化。2.體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC),采用GLP-1、GLP-1受體拮抗劑Exendin(9-39)、RAGE阻斷性抗體Anti-RAGE IgG、腺苷酸環(huán)化酶激活劑Forskolin、cAMP抑制劑SQ22536、PKA抑制劑H89、 Rho/ROCK激動劑LPA和抑制劑Fasudil分別或組合干預(yù),采用熒光染色激光共聚焦觀察肌動蛋白(F-actin)分布變化,通過G--LA試劑盒檢測RhoA活性,Western blot法和免疫熒光法檢測GLP-1R, RAGE、PKA、ROCK、MYPT和MLC蛋白的表達(dá)和磷酸化水平變化以探討GLP-1是否通過GLP-1受體途徑激動cAMP/PKA信號通路從而抑制Rho/ROCK介導(dǎo)的MLC磷酸化,從而對內(nèi)皮細(xì)胞骨架排列產(chǎn)生影響。結(jié)果：1.成功復(fù)制2型糖尿病大鼠模型,模型鼠血清空腹血糖、血脂、胰島素抵抗水平、內(nèi)皮素顯著增加,體重、血漿GLP-1和血清一氧化氮水平顯著降低,不同劑量西格列汀干預(yù)12周后空腹血糖、胰島素抵抗水平和內(nèi)皮素水平不同程度降低,體重、血漿GLP-1和血清一氧化氮水平不同程度提高,但血脂無顯著變化。2.2型糖尿病大鼠胸主動脈內(nèi)皮舒張功能顯著減退,內(nèi)皮細(xì)胞間間隙和內(nèi)膜通透性顯著增加,而大劑量西格列汀干預(yù)12周后主動脈內(nèi)皮舒張功能顯著提高,內(nèi)皮細(xì)胞間間隙和內(nèi)膜通透性不同程度的減小。3.2型糖尿病大鼠主動脈GLP-1R表達(dá)水平顯著下降,而RAGE、ROCK、MLCK表達(dá)和MYPT、MLC磷酸化水平及RhoA活性顯著上調(diào)。不同劑量西格列汀干預(yù)12周后不同程度的上調(diào)GLP-1R表達(dá)水平,并下調(diào)RAGE、ROCK、MLCK表達(dá)和MYPT、 MLC磷酸化水平及RhoA活性。4.正常內(nèi)皮細(xì)胞骨架F-actin主要分布在細(xì)胞周邊、胞膜內(nèi)側(cè),呈網(wǎng)狀分布,靠近細(xì)胞連接處呈細(xì)絲狀排列,線條完整連續(xù),細(xì)胞中央應(yīng)力纖維不明顯。給予200mg／1的AGEs刺激HUVECs單層24h,細(xì)胞骨架F-actin外周致密帶邊緣變的粗糙不整、排列較紊亂,細(xì)胞邊界己難以辨認(rèn),F-actin重組,從細(xì)胞周邊向細(xì)胞中心轉(zhuǎn)移并成平行束樣堆積、增厚,細(xì)胞中央應(yīng)力纖維形成。Anti-RAGE IgG、Forskolin、Fasudil、 GLP-1能不同程度的恢復(fù)F-actin分布,而GLP-1的作用可被Exendin (9-39)、SQ22536、H89和LPA顯著減弱。5. AGEs顯著上調(diào)HUVECs的RAGE、ROCK、MLCK表達(dá)和MYPT、MLC磷酸化水平及RhoA活性,下調(diào)GLP-1R表達(dá)。6. Anti-RAGE IgG可下調(diào)AGEs刺激的HUVECs的RAGE、ROCK表達(dá)和MYPT、MLC磷酸化水平及RhoA活性,上調(diào)GLP-1R表達(dá)水平。7. Forskolin可下調(diào)AGEs刺激的HUVECs的RAGE、ROCK表達(dá)和MYPT、MLC磷酸化水平及RhoA活性。8. Fasudil可下調(diào)AGEs刺激的HUVECs的MYPT、MLC磷酸化水平及RhoA活性。9.GLP-1顯著下調(diào)AGEs刺激的HUVECs的RAGE、ROCK表達(dá)和MYPT、MLC磷酸化水平及RhoA活性,上調(diào)GLP-1R表達(dá)和PKA磷酸化水平,而GLP-1上述作用可被Exendin (9-39)、SQ22536、H89和LPA顯著減弱。結(jié)論：1.2型糖尿病大鼠胸主動脈內(nèi)膜通透性明顯增加,AGEs刺激的內(nèi)皮細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)重排�？赡苡捎谛罘e的AGEs通過其受體(RAGE)途徑激活內(nèi)皮細(xì)胞Rho/ROCK信號通路從而促進(jìn)MYPT磷酸化,導(dǎo)致MLC磷酸化水平提高,內(nèi)皮細(xì)胞收縮,細(xì)胞間隙增大。2.提高活性GLP-1水平,激動GLP-1R可以緩解2型糖尿病大鼠胸主動脈內(nèi)膜和AGEs刺激的內(nèi)皮細(xì)胞單層高通透性,可能由于GLP-1抑制內(nèi)皮細(xì)胞RAGE表達(dá),下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞Rho/ROCK信號通路從而抑制MYPT磷酸化和MLCK表達(dá),導(dǎo)致MLC磷酸化水平降低。3.GLP-1改善糖尿病狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)重排的機(jī)制可能為：GLP-1通過激動其受體(GLP-1R),激動cAMP/PKA信號通路,抑制RAGE表達(dá),從而下調(diào)Rho/ROCK信號通路,最終抑制MYPT和MLC磷酸化水平,使內(nèi)皮細(xì)胞向心性收縮力減小。
[Abstract]:Background Global Type 2 diabetes mellitus is increasing and has become a worldwide health problem and economic burden . The harm caused by diabetes lies mainly in the disability caused by various complications , and the greatest harm caused by chronic complications such as large blood vessels and microvessels . In the course of development of diabetic vascular disease , the accelerated formation of advanced advanced end products ( AGE ) and its accumulation in vascular tissue play an important role . Objective To study the effects of GLP - 1 on vascular endothelial cell membrane permeability in diabetic rats . The effects of GLP - 1 on endothelium - relaxing function of aorta were observed in rats with type 2 diabetes mellitus . Anti - RAGE IgG , Forskolin , Fasudil , GLP - 1 could restore the F - actin distribution in different degrees , while GLP - 1 could be significantly attenuated by Ex4 ( 9 - 39 ) , SQ22536 , H89 , and lpa . The expression of RAGE , ROCK , MLCK , MYPT , MLC phosphorylation and RhoA activity were significantly increased and the expression of GLP - 1R was downregulated . Anti - RAGE IgG could down - regulate the RAGE , ROCK expression and MYPT , MLC phosphorylation level and RhoA activity , and up - regulate the expression level of GLP - 1R . Forskolin can downregulate the RAGE , ROCK expression and MYPT , MLC phosphorylation level and RhoA activity of cultured vascular endothelial cells . Conclusion : 1 . The expression of RAGE , ROCK and the activity of MYPT , MLC phosphorylation , and the activity of RhoA can decrease the level of phosphorylation of MYPT , regulate the level of phosphorylation of MCP - 1R , and increase the level of phosphorylation of MLCK . Conclusion : It is suggested that GLP - 1 can inhibit the expression of endothelial cell RAGE , regulate the phosphorylation of the endothelial cells , and increase the level of phosphorylation of MLCK . Therefore , it is possible to decrease the level of phosphorylation of the endothelial cells .
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R54

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本文編號：2086705