本文選題：硫化氫 + 一氧化氮�。� 參考：《河北醫(yī)科大學》2015年博士論文

【摘要】：心血管疾病的發(fā)病原因及對機體的損傷已越來越受到臨床和研究的關注。在人群中,高血壓(hypertension)和高血脂(hyperlipidemia)是引起血管系統(tǒng)疾病的常見原因,尤其是動脈粥樣硬化(atherosclerosis)形成的重要危險因素。隨著研究的進行,一氧化氮(nitric oxide,NO),一氧化碳(carbon monoxide,CO),硫化氫(hydrogen sulfide,H2S)被認為是體內的三種氣體信號分子,在多種系統(tǒng)發(fā)揮著廣泛的調節(jié)作用。NO一直被認為是內皮依賴性的舒張因子,是內臟和全身血液循環(huán)的關鍵調節(jié)因素�？烧{節(jié)細胞增殖和心血管中樞活動。抑制NO的產(chǎn)生可以劑量依賴性的使血壓升高并可引起相關的機體損傷,在大鼠使用L-NAME阻斷了NO的產(chǎn)生可引起脂代謝的代謝異常和升高膽固醇的水平,在高膽固醇血癥的模型上NO的降低可觀察的內皮功能的損傷和動脈粥樣硬化。H2S自發(fā)現(xiàn)以來一直被認為是一種毒性氣體。近年研究發(fā)現(xiàn)可以在哺乳動物體內內源性生成。研究報道內源性H2S對心血管系統(tǒng)有一定的保護作用。動物實驗中發(fā)現(xiàn),外源性應用H2S可保護心臟的缺血再灌注損傷,H2S可以降低自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)的血壓。但H2S對于肝臟的作用卻研究較少,已有研究發(fā)現(xiàn)H2S可以保護CCl4和門靜脈結扎所致的大鼠肝硬化損傷,H2S同樣可以保護肝臟的缺血再灌注損傷。應用L-NAME導致的高血壓大鼠模型除了表現(xiàn)為血壓升高外還伴隨著血清脂質和脂蛋白的異常。如能探明在肝臟中H2S與NO的關系以及內源性H2S水平與心血管疾病危險因素的關系,則可對心血管疾病的防治提供新的思路。第一部分硫化氫抗L-NAME所致的大鼠肝臟損傷和心血管風險目的:通過復制亞硝基左旋精氨酸(NG nitro-L-arginine methylester,L-NAME)誘導的大鼠模型并外源性給予H2S的供體硫氫化鈉(Na HS,sodium hydrosulfide)和格列苯脲(glibenclamide,Gli,KATP通道阻斷劑),以研究H2S對L-NAME所致的大鼠肝損傷的保護作用和心血管風險。方法:健康雄性Sprague-Dawley大鼠36只,動物隨機分為6組,分別為:對照(con組),L-NAME組,con+格列苯脲組(con+Gli組),con+硫氫化鈉組(con+Na HS組),L-NAME+Na HS組,L-NAME+Na HS+Gli組,每組各6只。硫氫化鈉組大鼠采用硫氫化鈉(56μmol/kg)每日腹腔射;其余組大鼠每日腹腔注射相應劑量的生理鹽水。L-NAME組大鼠給予配制好的L-NAME水溶液每日日常飲用。格列苯脲組大鼠給予配制好的格列苯脲水溶液每日日常飲用。各組大鼠每周測量尾動脈收縮壓。大鼠給予處理5周后,留取血清和肝臟組織測量血清甘油三脂(TG,triglycerides),高密度脂蛋白(HDL,high-density lipoprotein),低密度脂蛋白(LDL,low-density lipoprotein),總膽固醇(CHO total cholesterol),谷丙轉氨酶(ALT,glutamic-pyruvic transaminase);通過顯微鏡觀察肝組織細胞排列,組織學結構穩(wěn)定程度,門管區(qū)結構,脂肪空泡出現(xiàn)和淋巴細胞浸潤等。結果:1大鼠模型評價:與con組大鼠相比,各組大鼠的食物攝入量和水的攝入量和體重隨實驗周數(shù)逐漸增加,組間差異無統(tǒng)計學意義。各組大鼠均未出現(xiàn)嚴重疾病、死亡的情況。2大鼠血壓的變化:在給予處理前各組的尾動脈收縮壓無統(tǒng)計學差異。在給予處理后,L-NAME組大鼠的尾動脈收縮壓逐漸升高,L-NAME+Na HS組血壓較L-NAME組顯著降低。L-NAME+Na HS+Gli組血壓較L-NAME+Na HS組血壓升高,與L-NAME組比較無統(tǒng)計學差異。3肝功能指標的變化:血清CHO和ALT各組之間沒有統(tǒng)計學差異。con組,con+Na HS組,con+Gli組的LDL和TG含量各組之間沒有統(tǒng)計學差異。L-NAME組LDL和TG較con組明顯升高,L-NAME+Na HS組,L-NAME+Na HS+Gli組的LDL和TG較L-NAME組比明顯降低,但兩組之間沒有統(tǒng)計學差異。con組,con+Na HS組,con+Gli組的HDL含量各組之間沒有統(tǒng)計學差異。L-NAME組HDL較con組明顯降低。L-NAME+Na HS組,L-NAME+Na HS+Gli組的HDL較L-NAME組比明顯升高,但兩組之間沒有統(tǒng)計學差異。4肝臟組織病理形態(tài)學觀察:肝臟組織HE染色后鏡下可見con組,con+Na HS組,con+Gli組肝小葉結構清晰、完整,肝細胞以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀整齊排列。L-NAME組肝小葉結構紊亂,纖維結締組織增生,部分肝細胞體積增大、胞漿內可見大小不等圓形空泡,部分肝細胞可見氣球樣變;中央靜脈周圍及匯管區(qū)可見炎性細胞浸潤。L-NAME+Na HS組和L-NAME+Na HS+Gli組的肝臟組織病理學變化介于con組和L-NAME組之間。小結:本研究證實應用NO合酶抑制劑L-NAME造成大鼠血壓的升高、肝臟的損傷和血清肝臟功能相關指標的變化。應用H2S的供體Na HS可以降低L-NAME誘導的大鼠血壓的升高并保護其肝臟的損傷,下調血壓的作用可以被KATP通道的阻斷劑格列苯脲阻斷,但苯脲阻斷不能阻斷H2S對肝臟的保護作用。第二部分硫化氫通過調節(jié)e NOS/AKT抗L-NAME所致的大鼠肝臟損傷目的:復制L-NAME誘導的大鼠模型并外源性給予H2S的供體Na HS和格列苯脲(Gli),通過檢測血漿中NO和H2S以及使用分子生物學技術研究H2S保護L-NAME所致的大鼠肝臟損傷的作用機制。方法:健康雄性Sprague-Dawley大鼠36只,動物隨機分為6組,分別為:對照(con組),L-NAME組,con+格列苯脲組(con+Gli組),con+硫氫化鈉組(con+Na HS組),L-NAME+Na HS組,L-NAME+Na HS+Gli組,每組各6只。硫氫化鈉組大鼠采用硫氫化鈉(56μmol/kg)每日腹腔射;其余組大鼠每日腹腔注射相應劑量的生理鹽水。L-NAME組大鼠給予配制好的L-NAME水溶液每日日常飲用。格列苯脲組大鼠給予配制好的格列苯脲水溶液每日日常飲用。大鼠給予處理5周后,留取血漿和肝臟組織測量血漿H2S的含量,測量肝組織中NO的含量,Western blot法檢測肝臟組織e NOS,P-e NOSs1177,AKT,P-AKTs473蛋白表達。結果:1血漿H2S含量的變化:con組,con+Na HS組,con+Gli組的血漿H2S含量各組之間沒有統(tǒng)計學差異。L-NAME組血漿H2S較con組明顯降低。L-NAME+Na HS組,L-NAME+Na HS+Gli組的血漿H2S較L-NAME組比明顯升高,但兩組之間沒有統(tǒng)計學差異。2肝臟組織NO的變化:con組,con+Na HS組,con+Gli組的肝臟組織NO含量各組之間沒有統(tǒng)計學差異。L-NAME組肝臟組織NO較con組明顯降低。L-NAME+Na HS組,L-NAME+Na HS+Gli組的肝臟組織NO分別較L-NAME組比明顯升高,兩組之間沒有統(tǒng)計學差異。3肝臟組織蛋白表達:結果采用目的蛋白的灰度值與內部參照GADPH作比較。con組,con+Na HS組,con+Gli組的肝臟組織e NOS,P-e NOSs1177,AKT,P-AKTs473蛋白表達各組之間均沒有統(tǒng)計學差異。L-NAME組肝臟組織e NOS,P-e NOSs1177,AKT,P-AKTs473蛋白表達均較con組明顯降低。L-NAME+Na HS組,L-NAME+Na HS+Gli組的肝臟組織e NOS,P-e NOSs1177,AKT,P-AKTs473蛋白表達均較L-NAME組比明顯升高,但兩組之間沒有統(tǒng)計學差異。小結:本研究證實應用NO合酶的抑制劑L-NAME大鼠血漿H2S和NO含量降低,下調了肝臟組織e NOS,P-e NOSs1177,AKT,P-AKTs473蛋白的表達。應用H2S的供體Na HS可以上調L-NAME誘導的大鼠血漿H2S和NO含量,上調肝臟中與NO合成相關蛋白的表達。這種調節(jié)作用不能被格列苯脲阻斷,即不是通過KATP通道發(fā)揮的作用,可能是通過激活AKT-e NOS通路起到的。第三部分硫化氫通過調節(jié)e NOS/AKT抗L-NAME所致的大鼠肝細胞損傷目的:通過體外培養(yǎng)原代肝細胞實驗,來探討H2S體外應用是否可通過直接調節(jié)e NOS/AKT途徑而保護L-NAME所致的大鼠肝細胞損傷即通過調節(jié)e NOS/AKT的磷酸化上調肝臟細胞一氧化氮的生成。方法:肝臟細胞的分離和培養(yǎng)參Sprague-Dawley雄性大鼠通過門靜脈灌流消化液方法分離肝臟細胞,并采用臺盼藍排斥法測定肝細胞活力。選取細胞活率在90%以上的肝細胞進行培養(yǎng)。肝臟原代細胞分為對照組(con組),con+Na HS(100μmol/L)組,L-NAME(100μmol/L)組,L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)組,L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)+Gli(100μmol/L)組,L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)+LY294002(20μmol/L)組。藥物作用時間均為8小時。收集細胞培養(yǎng)基上清檢測NO的含量,采用NO的特異性熒光探針DAF-FM DA(3-Amino,4-aminomethyl-2',7'-difluorescein,diacetate)測量細胞內NO的變化,western blot法檢測肝臟原代細胞中e NOS,P-e NOSs1177,AKT,P-AKTs473蛋白表達。結果:1肝原代細胞生長情況:本實驗成功分離大鼠肝細胞,平均細胞活力92.5士0.68%.倒置顯微鏡下觀察,新分離的離體肝細胞為透亮圓形,呈單個分散狀態(tài)。細胞培養(yǎng)2h后開始出現(xiàn)貼壁、伸展現(xiàn)象,培養(yǎng)24h后大約90%的肝細胞完全貼壁,貼壁的肝細胞呈典型的上皮細胞樣的多角形,胞體變平變薄,體積明顯增大,可見許多雙核細胞,細胞間開始出現(xiàn)島狀連接。少數(shù)活力差的細胞懸浮于培養(yǎng)液中,換液時可以去除。培養(yǎng)2d后,貼壁生長的肝細胞的形態(tài)改變更加明顯,肝細胞拉平、伸展,緊緊粘附于培養(yǎng)瓶底壁,相互融合,連接成片、島狀。2細胞上清中NO含量變化:con組,con+Na HS(100μmol/L)組的細胞上清中NO含量之間沒有統(tǒng)計學差異。L-NAME組細胞上清中NO含量較con組明顯降低。L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)組,L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)+Gli(100μmol/L)組的細胞上清中NO含量較L-NAME組比明顯升高,但兩組之間沒有統(tǒng)計學差異。L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)+LY294002(20μmol/L)組細胞上清中NO含量與L-NAME組比沒有統(tǒng)計學差異。3細胞中NO含量的變化:con組,con+Na HS(100μmol/L)組的細胞中NO的生成較為相近。L-NAME組細胞中NO的生成較con組明顯降低。L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)組,L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)+Gli(100μmol/L)組的細胞中NO的生成較L-NAME組比明顯升高,但兩組之間沒有統(tǒng)計學差異。L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)+LY294002(20μmol/L)組細胞中NO的生成與L-NAME組比沒有統(tǒng)計學差異。4細胞中相關蛋白的變化:Western blot法檢測肝臟細胞中e NOS,P-e NOSs1177,AKT,P-AKTs473蛋白表達。結果采用目的蛋白的灰度值與內部參照GADPH作比較。各組的肝臟細胞中e NOS,AKT,蛋白表達各組之間均沒有統(tǒng)計學差異。con組,con+Na HS(100μmol/L)組P-e NOSs1177,P-AKTs473蛋白表達各組之間均沒有統(tǒng)計學差異。L-NAME組細胞中P-e NOSs1177,P-AKTs473蛋白表達較con組明顯降低。L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)組,L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)+Gli(100μmol/L)組細胞中P-e NOSs1177,P-AKTs473蛋白表達均較L-NAME組比明顯升高,但兩組之間沒有統(tǒng)計學差異。L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)+LY294002(20μmol/L)組細胞中P-e NOSs1177,P-AKTs473蛋白表達與L-NAME組比沒有統(tǒng)計學差異。小結:本研究證實應用NO合酶抑制劑L-NAME后大鼠肝臟原代細胞NO生成減少,此作用是通過下調肝臟細胞P-e NOSs1177,P-AKTs473蛋白的表達即減低了e NOS,AKT的磷酸化。應用H2S的供體Na HS可以上調肝臟原代細胞NO的生成和相關蛋白的表達。這種調節(jié)作用不能被格列苯脲阻斷,可以被AKT的阻斷劑LY294002阻斷,表明H2S調節(jié)NO生成不是通過KATP通道發(fā)揮的作用;而是通過激活AKT-e NOS通路實現(xiàn)的。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R54

【參考文獻】

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1 岳雅倫;宋麗秀;鄭娜娜;張傳峰;張寧;韓延智;陳衛(wèi)剛;鄭勇;;外源性硫化氫在PI3K/Akt通路對大鼠纖維化肝細胞增殖、凋亡的影響[J];世界華人消化雜志;2014年36期

2 劉禹;蘭海楠;李維;楊艷紅;付志玲;馬思慧;吳天成;郭風;趙雪;張輝;崔煥忠;吳e，

本文編號：2066997