本文選題：環(huán)狀RNA + 血管平滑肌細胞��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一類無5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴結(jié)構(gòu)、以共價鍵形成的環(huán)形內(nèi)源非編碼RNA。與線性RNA相比,不受RNA外切酶、脫腺苷、脫帽的影響,表達更加穩(wěn)定。已有研究證明,circRNA存在于各種細胞當(dāng)中,具有組織細胞和發(fā)育階段特異性,參與了細胞增殖、凋亡、衰老等生物學(xué)過程。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)異常增殖和凋亡,是動脈粥樣硬化等血管重塑性疾病形成與發(fā)展的重要病理學(xué)事件。CircRNA是否參與VSMCs增殖調(diào)控,分子機制如何?迄今尚不清楚。本研究中我們采用基因芯片技術(shù),篩查分析人主動脈平滑肌細胞(human aortic smooth muscle cells,HASMCs)增殖相關(guān)circRNA和mRNA表達譜,從circRNA作為micro RNA海綿、編碼蛋白質(zhì)等角度進行生物信息學(xué)分析,為后續(xù)circRNA的分子機制探究提供線索;然后,對候選circRNA進行敲降或過表達干預(yù),探討其對HASMCs增殖、凋亡的影響。以期為VSMC增殖性疾病的發(fā)病機制研究提供新思路,為發(fā)掘新型治療靶點提供依據(jù)。方法:1基因芯片分析circRNA和mRNA表達譜采用基因芯片對PDGF誘導(dǎo)的增殖型和血清饑餓誘導(dǎo)的靜止型HASMCs中的circRNA和mRNA表達譜進行分析,差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為fold change≥2或≤-2,P0.05。2差異表達circRNA的qRT-PCR驗證選取13種差異表達的circRNA,分別在環(huán)化位點兩側(cè)設(shè)計反向(divergent)引物,通過實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)技術(shù),檢測它們在增殖型和靜止型HASMCs中的表達水平,通過2-ΔΔCt法計算差異倍數(shù)。3差異circRNA和mRNA的生物信息學(xué)分析對差異表達的mRNA和差異表達的circRNA宿主基因進行GO(Gene ontology)分析,GO包括分子功能、生物過程以及細胞組成等,同時進行pathway分析。結(jié)合現(xiàn)有的AGO2沉淀的RNA測序數(shù)據(jù)[1],篩選與AGO2結(jié)合,可能作為micro RNA海綿的差異表達circRNA。選取其中5種circRNA,通過生物信息學(xué)軟件分別預(yù)測它們可能結(jié)合的micro RNA,然后分析這些micro RNA可能調(diào)控的差異mRNA,構(gòu)建circRNA-micro RNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)。對差異表達的circRNA與其對應(yīng)的線性mRNA的表達相關(guān)性進行分析。并通過circRNADb平臺,分析篩選可能編碼蛋白質(zhì)的circRNA。4 circRNA對HASMCs增殖、凋亡的影響基于circRNA的環(huán)化位點設(shè)計合成特異的si RNA,轉(zhuǎn)染HASMCs,通過q RT-PCR驗證敲降效率,通過Western Blot檢測相關(guān)蛋白的表達水平,通過流式細胞術(shù)檢測細胞周期、細胞磷脂酰絲氨酸外翻情況,分析細胞增殖、凋亡狀態(tài)。5 circRNA表達載體構(gòu)建根據(jù)has_circ_0001304以及has_circ_0040705的序列設(shè)計引物,引物5'端引入Eco R I酶切位點,3'端引入Xba I酶切位點。提取RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后進行PCR擴增,瓊脂糖凝膠電泳后對目的條帶進行膠回收,經(jīng)Eco R I/Xba I雙酶切后回收片段,插入pc DNA3_1(+)CircRNA Mini Vector真核基因表達載體中,轉(zhuǎn)化后挑取單菌落,進行菌落PCR和雙酶切鑒定,最后進行測序分析。結(jié)果:1基因芯片結(jié)果顯示,與靜止型HASMCs相比,增殖型HASMCs中有66種circRNA表達水平出現(xiàn)上調(diào),68種circRNA表達水平降低;有3019種mRNA表達上調(diào),701種mRNA表達下調(diào)。2通過qRT-PCR技術(shù),檢測13種circRNA在增殖型HASMCs和靜止型HASMCs的表達水平。結(jié)果顯示,12種circRNA的表達差異與基因芯片的結(jié)果一致。3 GO分析顯示差異表達的circRNA相關(guān)的mRNA可以參與到蛋白運輸(protein transport)等細胞活動中;Pathway分析發(fā)現(xiàn)最有意義的腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine Monophosphate activated protein kinase,AMPK)和micro RNA兩個通路。而對于差異表達的mRNA,GO分析可知其參與到細胞周期阻滯負向調(diào)節(jié)(negative regulation of cell cycle arrest)等生物過程,而pathway分析可知涉及的通路包括促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)等信息傳遞和增殖相關(guān)通路。通過分析發(fā)現(xiàn),78種差異circRNA能夠與AGO2結(jié)合,可能作為micro RNA海綿發(fā)揮作用。選取其中的5種circRNA:hsa_circ_0000069、hsa_circ_0002579、hsa_circ_0004872、hsa_circ_0006371、hsa_circ_0040705,構(gòu)建circRNA-micro RNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò),結(jié)果顯示,它們與通過micro RNA的介導(dǎo)C2orf44,IGF2BP1,HMGA2,KLF7等254種差異基因具有共表達相關(guān)性,為后續(xù)探究circRNA的調(diào)控靶點提供了重要線索。對差異表達的circRNA與其對應(yīng)的線性mRNA的表達相關(guān)性進行分析,發(fā)現(xiàn)circRNA與其對應(yīng)的線性mRNA的表達沒有相關(guān)性。通過circRNADb平臺,篩選得到24種circRNA含有核糖體進入序列和開放閱讀框,提示它們可能編碼蛋白質(zhì)。4采用siRNA敲降HASMCs中的has_circ_0040705和has_circ_0001304,Western Blot分析表明,細胞增殖標(biāo)志基因PCNA水平顯著降低,VSMC表型分化標(biāo)志基因SM22a、凋亡相關(guān)蛋白Bax的水平顯著升高。流式細胞術(shù)分析表明,敲降has_circ_0040705或has_circ_0001304均能促進HASMCs凋亡。此外,敲降has_circ_0001304能夠明顯抑制QKI蛋白的表達。5經(jīng)酶切鑒定、測序分析證明,成功構(gòu)建has_circ_0001304和has_circ_0040705的真核表達載體,為下一步功能與機制研究奠定了基礎(chǔ)。結(jié)論:1在HASMCs增殖過程中,許多circRNA表達水平發(fā)生改變。通過生物信息學(xué)分析表明,circRNA可能通過作為micro RNA海綿、編碼蛋白質(zhì)等途徑發(fā)揮調(diào)控功能;2 Has_circ_0040705和has_circ_0001304具有促進HASMCs增殖、抑制細胞凋亡的功能,是潛在的VSMC增殖性疾病的干預(yù)靶點。
[Abstract]:Objective : To investigate the effects of RNA and RNA expression on proliferation and apoptosis of vascular smooth muscle cells ( HASMC ) . 閫氳繃2-螖螖Ct娉曡綆楀樊寮傚，

本文編號：2039127