本文選題：miR-4787-5p + miR-4306��； 參考：《鄭州大學》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景及目的急性主動脈夾層(Acute Aortic Dissection,AAD)是一種急性發(fā)作、進展快速、死亡率及致殘率較高的危重心血管急癥。據(jù)研究報道,AAD發(fā)病率約3.5例/(10萬人年),約50%死于48h內,院內死亡率約20%-30%,10年死亡率可達37%-53%。隨著醫(yī)療技術水平的提高,AAD的死亡率已明顯下降,但與冠心病等其它心血管疾病相比,我國AAD的整體治療水平仍不高,AAD的誤診率、漏診率、死亡率依然較高。因此,進一步了解AAD的發(fā)病過程,對指導研究AAD的早期診斷、及時有效的治療及并發(fā)癥的預防具有重要意義。目前國內外關于AAD的發(fā)病機制研究甚多,但是其分子發(fā)病機制至今尚未完全闡明。微小RNA(micro RNA,miRNA)是一類內源性、非編碼、小的RNA分子,長約18-22個核苷酸,具有超強的穩(wěn)定性,通過與靶基因的3’端非編碼區(qū)(3’-untranslated region,3’UTR)結合調控其轉錄水平、翻譯水平,然后參與細胞增殖、分化及凋亡等相關的生物學功能的調控。有研究顯示,miRNA可以廣泛且穩(wěn)定的在外周血漿或血清中存在,并能通過實時熒光定量RT-PCR(Fluorescence quantitative Reverse Transcription-polymerase Chain Reacto,q RTPCR)的方法檢測出來。miRNA表達水平可以隨著疾病的病理生理變化而發(fā)生改變,因而廣泛參與調控各種疾病的發(fā)病過程,已有研究發(fā)現(xiàn)miRNA在AD的發(fā)病過程中起著主要作用。為進一步探究miRNA在AAD中的表達情況,本實驗室前期已經(jīng)通過Agilengt miRNA芯片技術進行分析miRNA的表達譜,初步篩選出在AAD患者和正常人的外周血漿中差異表達的微小RNA,且選出2個表達差異明顯的miRNA,即miR-4787-5p和miR-4306。本實驗室先前的研究結果為miRNA-4787-5p在AAD與健康對照組血漿中的表達差異具有統(tǒng)計學意義,而miR-4306無統(tǒng)計學意義,這與miRNAs芯片結果不一致。為了能更精確的驗證差異表達miRNAs在AAD的表達水平,減小實驗誤差,本次研究將通過采用熒光定量RT-PCR方法擴大樣本量進一步驗證血漿中的miR-4787-5p和miR-4306在AAD患者與健康對照組表達水平的差異性。并且,本研究還將初步探索miR-4787-5p和miR-4306在AAD中的靶基因,進而初步探討其在AAD發(fā)病機制中的作用。研究方法本實驗分為兩組:急性主動脈夾層患者組(AAD組)和健康對照組(Control組)。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準,與所有入組者簽署知情同意書。分別收集2015年1月~2017年1月就診于鄭州大學第一附屬醫(yī)院并且確診為AAD的患者和年齡、性別配比相同的健康對照組的外周靜脈血血漿,詳細記錄入組者的基本臨床資料,包括入院時的血壓及24小時之內的D-二聚體、C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)、腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)、白細胞(white blood cell,WBC)、紅細胞(red blood cell,RBC)、血紅蛋白(hemoglobin,Hb)、血小板(platelet,PLT)及心臟彩超測得的升主動脈寬度等。首先,將兩組的基本臨床資料進行獨立樣本的t檢驗或卡方檢驗,選擇具有統(tǒng)計學意義的指標與是否發(fā)生AAD進行相關性分析。然后,采用q RT-PCR的方法擴大樣本量驗證AAD組與對照組血漿中的miR-4787-5p和miR-4306表達水平的差異,并且應用受試者工作曲線(receiver operating characteristic,ROC)計算曲線下面積(area under the receiver operating characteristic curve,AUC)以表明miR-4787-5p和miR-4306對AAD早期診斷的敏感性和特異性。最后,通過生物信息學軟件分析推測得到miR-4787-5p和miR-4306的靶基因,并且應用雙熒光素酶報告基因實驗的方法驗證靶基因的準確性。結果1.按排除標準共收集AAD患者102例,其中男性81例,女性21例,年齡28~78歲,平均52.3±10.4歲;對照組58例,男性48例,女性10例,年齡30~77歲,平均年齡53.3±11.6歲。兩組人群年齡、性別、吸煙史、飲酒史、高血脂病史差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05),兩組人群的高血壓病史、入院時血壓是否升高、升主動脈寬度、D-二聚體、CRP、BNP、WBC、RBC、Hb、PLT的差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.將AAD組和對照組之間具有統(tǒng)計學差異的指標與是否發(fā)生AAD進行雙變量相關性分析,結果顯示:紅細胞和血紅蛋白與AAD呈弱負相關關系,P0.05,相關系數(shù)為0.286、0.291;血小板與AAD呈一般負相關關系,P0.05,相關系數(shù)為0.411;高血壓與AAD呈一般正相關關系,P0.05,相關系數(shù)為0.383;入院時血壓升高、腦鈉肽與AAD呈顯著正相關關系,P0.05,相關系數(shù)為0.614、0.644;升主動脈寬度、白細胞、D-二聚體、C反應蛋白與AAD呈高度正相關關系,P0.05,相關系數(shù)分別為0.761、0.772、0.820、0.832。3.通過q RT-PCR擴大樣本量進行實驗,其結果為:AAD患者血漿中的miR-4787-5p和miR-4306的相對表達量均明顯高于健康對照組,分別為0.646±0.442 vs 0.189±0.116、0.780±0.323 vs 0.006±0.009,均P=0.0000.010.05,差異均具有統(tǒng)計學意義,且均與本實驗室前期的基因芯片檢測分析結果一致。應用ROC曲線進行分析,結果顯示miR-4787-5p對AAD檢測的敏感度78%,特異度為80%,AUC為0.834(95%CI,0.769-0.900),P=0.0000.05,具有統(tǒng)計學意義。miR-4306對AAD檢測的敏感度為86%,特異度為88%,AUC為0.921(95%CI,0.876-0.966),P=0.0000.05,具有統(tǒng)計學意義。4.應用生物信息學分析預測結果為:PKD1、TGF-β1的3’UTR區(qū)分別包含miR-4787-5p和miR-4306的作用靶點,可能是miR-4787-5p和miR-4306在AAD中的靶基因。5.雙熒光素酶報告實驗驗證結果為:共轉染miR-4787-5p agomir和含有PKD1野生型3’UTR區(qū)的重組載體組及共轉染miR-4306 agomir和含有TGF-β1野生型3’UTR區(qū)的重組載體組的細胞的熒光素酶活性出現(xiàn)明顯下調(P均0.05)。提示miR-4787-5p和miR-4306分別與PKD1 3’UTR區(qū)及TGF-β1 3’UTR區(qū)存在相互作用,且這種相互作用使得miR-4787-5p和miR-4306可分別負向調控PKD1和TGF-β1的表達。因此,研究證實PKD1、TGF-β1分別為miR-4787-5p和miR-4306在AAD中的靶基因。結論miR-4787-5p和miR-4306不僅對AAD具有一定的早期診斷價值,而且還可能是參與調控AAD發(fā)病機制的因素之一。
[Abstract]:The research background and the purpose of acute aortic dissection are acute attack , rapid progress , death rate and high disability rate . According to the study , the mortality rate is about 20 % -30 % , and the mortality rate is 37 % -53 % . The research shows that miRNA can be widely and stably in peripheral blood plasma or serum . In order to verify the difference of miR - 4787 - 5p and miR - 4306 in plasma of healthy control group , the difference of miR - 4787 - 5p and miR - 4306 in plasma of healthy control group was further verified by using quantitative RT - PCR . The results showed that the relative expression of miR - 4787 - 5p and miR - 4306 was significantly higher than that of healthy control group ( P0.05 ) . The results showed that miR - 4787 - 5p and miR - 4306 respectively contained the target genes of miR - 4787 - 5p and miR - 4306 . The results showed that miR - 4787 - 5p and miR - 4306 respectively contained the target genes of miR - 4787 - 5p and miR - 4306 .
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R543.1
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本文編號：2034880