本文選題：動脈粥樣硬化 + 腫瘤壞因子α��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是一種累及大中動脈的慢性炎癥性疾病[1-3],在其發(fā)生早期即單核細胞浸潤內(nèi)皮過程中涉及多種糖蛋白參與,但其具體機制尚不清楚。以往研究大多關(guān)注該過程黏附分子的表達情況,而對相關(guān)蛋白分子的蛋白質(zhì)翻譯后修飾對其影響的研究相對較少。故本課題將重點探討動脈粥樣硬化發(fā)生早期糖基化修飾水平的改變以及β-Catenin的α-2,6唾液酸化作用與單核細胞穿透內(nèi)皮細胞的相關(guān)性及分子機制,從而揭示糖基轉(zhuǎn)移酶ST6Gal-?在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展及消退過程的表達規(guī)律及生物功能,為今后動脈粥樣硬化的防治提供新的思路。第一部分ST6Gal-Ⅰ參與動脈粥樣硬化形成、進展及消退過程ApoE~(-/-)小鼠動脈粥樣硬化形成、進展及消退過程與ST6Gal-Ⅰ基因表達實驗?zāi)康?以ApoE~(-/-)小鼠為研究對象,高脂喂養(yǎng)小鼠構(gòu)建動脈粥樣粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展及藥物干預(yù)消退模型,初步確定動脈粥樣硬化發(fā)展過程與唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ST6Gal-Ⅰ)的表達相關(guān)性。實驗方法:1.采用高脂喂養(yǎng)ApoE~(-/-)小鼠16周,構(gòu)建動脈粥樣硬化發(fā)生組(基線模型組,baseline)、高脂喂養(yǎng)23周(發(fā)展組,development)及高脂喂養(yǎng)23周同時后7周給予瑞舒伐他汀灌胃處理(消退組,regression)。2.常規(guī)生化分析血清中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)。3.油紅O檢測主動脈根部斑塊面積大小。4.HE檢測主動脈根部病理變化。5.免疫組化檢測主動脈根部糖基轉(zhuǎn)移酶ST6Gal-Ⅰ的表達。實驗結(jié)果:1.ApoE~(-/-)小鼠經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)后,動脈粥樣硬化發(fā)展組與基線組相比,隨著高脂飼料喂養(yǎng)周數(shù)的增加,小鼠血清中LDL-C、HDL-C、TC、TG水平均升高,其中LDL-C及TG變化具有顯著性差異(P(27)0.05);消退組與發(fā)展組比較,LDL-C、TG水平均明顯下降,并有統(tǒng)計學(xué)差異(P(27)0.05)。血脂四項結(jié)果初步提示動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展及消退模型構(gòu)建成功。2.油紅O染色結(jié)果顯示,發(fā)展組小鼠主動脈根部斑塊面積大小明顯高于基線組(P(27)0.05),消退組明顯低于發(fā)展組(P(27)0.05)。各組小鼠主動脈根部斑塊面積大小結(jié)果進一步提示動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展及消退模型構(gòu)建成功。3.HE染色顯示與基線組相比動脈粥樣硬化發(fā)展組內(nèi)膜排列紊亂且異常增生,厚度明顯高于基線組(P(27)0.05),消退組明顯低于發(fā)展組(P(27)0.05)。表明動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展及消退模型構(gòu)建成功。4.動脈粥樣硬化發(fā)展組內(nèi)膜ST6Gal-Ⅰ的表達明顯高于基線組,消退組ST6Gal-Ⅰ的表達較發(fā)展組出現(xiàn)明顯的回升。實驗結(jié)論:動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展及消退過程可能與糖基轉(zhuǎn)移酶ST6Gal-Ⅰ表達密切相關(guān)。第二部分TNF-α通過ST6GAL-?影響內(nèi)皮細胞中功能蛋白唾液酸化,進而影響單核穿透內(nèi)皮細胞的功能實驗?zāi)康?以人臍靜脈內(nèi)皮細胞株EA.hy926為研究對象,TNF-α刺激內(nèi)皮細胞構(gòu)建動脈粥樣硬化炎癥損傷體外模型,分析在炎癥作用下內(nèi)皮細胞ST6Gal-Ⅰ表達及單核細胞穿透內(nèi)皮功能的變化。實驗方法:1.采用臺盼藍染色法,驗證TNF-α對內(nèi)皮細胞存活率的影響。2.Western blot、免疫熒光及流式細胞術(shù)檢測TNF-α處理后,EA.hy926細胞中ST6Gal-Ⅰ及總蛋白的α-2,6唾液酸化水平的變化情況。3.單核-內(nèi)皮細胞transwell小室三維立體共培養(yǎng)驗證TNF-α處理EA.hy926細胞后,單核細胞穿透內(nèi)皮細胞功能的影響。4.利用si RNA構(gòu)建ST6Gal-Ⅰ的瞬時干擾模型,WB及流式細胞術(shù)驗證模型是否構(gòu)建成功。5.ST6Gal-Ⅰ干擾后,驗證單核穿透內(nèi)皮細胞功能變化。6.Western blot檢測TNF-α處理EA.hy926細胞對FAK信號通路的影響。實驗結(jié)果:1.與對照組相比,TNF-α在0-50ng/ml濃度范圍處理EA.hy926對細胞的存活率基本無影響。2.與對照組相比,TNF-α處理EA.hy926細胞后,WB結(jié)果顯示細胞中ST6Gal-Ⅰ表達水平均明顯下降,SNA-blot結(jié)果顯示,細胞中總唾液酸化蛋白均呈下降趨勢,且在10-20ng/ml具有統(tǒng)計學(xué)差異(P(27)0.05)。免疫熒光及流式的結(jié)果均顯示TNF-α刺激EA.hy926細胞后,細胞表面SNA標志蛋白明顯下降。3.在transwell小室共培養(yǎng)單核-內(nèi)皮細胞模型中,與對照組相比,隨著TNF-α濃度的升高,熒光標記的單核細胞穿透內(nèi)皮細胞細胞數(shù)量逐漸增多,酶標儀檢測下槽的熒光強度值也是逐漸增強的(P(27)0.05),表明單核細胞穿透內(nèi)皮細胞功能明顯增強。4.si RNA干擾后,細胞中ST6Gal-?、SNA標志蛋白表達及流式檢測細胞表面SNA標志蛋白水平均明顯低于對照組(P(27)0.05)。且單核細胞穿透內(nèi)皮細胞數(shù)量明顯增多,transwell下室單核細胞的熒光強度明顯增強(P(27)0.05)5.Western blot檢測顯示,TNF-α處理EA.hy926細胞FAK磷酸化水平明顯上升。實驗結(jié)論:TNF-α誘導(dǎo)EA.hy926細胞ST6Gal-?及總蛋白的α-2,6唾液酸化水平明顯下降,且單核穿透內(nèi)皮細胞的功能明顯增強,即內(nèi)皮細胞遭到破壞。第三部分ST6Gal-?調(diào)控β-Catenin唾液酸化的分子機制實驗?zāi)康?以EA.hy926為研究對象,TNF-α刺激內(nèi)皮細胞構(gòu)建動脈粥樣硬化炎癥損傷體外模型,分析在炎癥作用下與緊密連接相關(guān)的蛋白是否發(fā)生α-2,6唾液酸化及細胞之間緊密連接的變化。實驗方法:1.采用免疫共沉淀及免疫印跡法,驗證TNF-α對內(nèi)皮細胞緊密連接相關(guān)蛋白的α-2,6唾液酸化的影響。2.免疫熒光進一步驗證細胞膜表面靶蛋白β-catenin的α-2,6唾液酸化水平。3.電鏡觀察正常組、炎癥刺激組及過表達ST6Gal-?炎癥刺激組細胞與細胞之間緊密連接的變化。實驗結(jié)果:1.IP結(jié)果顯示,炎癥刺激前后Integrinα5、N-Cadherin、p-β-Catenin和β-Catennin本身的表達量并未發(fā)生明顯變化,Integrinα5和N-Cadherin的α-2,6唾液酸化水平也未發(fā)生改變,而p-β-Catenin和β-Catennin的α-2,6唾液酸化水平相對于對照組明顯下降。2.免疫熒光結(jié)果顯示,炎癥刺激內(nèi)皮后,細胞膜表面p-β-Catenin的完整性遭到破壞。3.電鏡結(jié)果顯示,對照組內(nèi)皮細胞間連接緊密,炎癥刺激后,內(nèi)皮細胞緊密連接變得松散,緊密連接結(jié)構(gòu)遭到了破壞,而在過表達ST6Gal-?同時給予炎癥刺激時,與炎癥組相比,細胞之間的緊密連接出現(xiàn)了明顯的回復(fù)現(xiàn)象,細胞與細胞之間的連接變得緊密了。實驗結(jié)論:EA.hy926細胞與細胞之間緊密連接的變化可能是由ST6Gal-?催化β-Catenin的α-2,6唾液酸化引起的。
[Abstract]:This study focused on the changes of atherosclerotic formation , progression and regression , and the mechanism of molecular mechanism . The results showed that the changes of the early glycosylation modification level of atherosclerosis and the expression of 偽 - 2,6 Sialic acid and the mechanism of molecular mechanism were studied .
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R543.5

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本文編號：2011968