本文選題：動(dòng)脈粥樣硬化 + 腫瘤壞因子α��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是一種累及大中動(dòng)脈的慢性炎癥性疾病[1-3],在其發(fā)生早期即單核細(xì)胞浸潤(rùn)內(nèi)皮過(guò)程中涉及多種糖蛋白參與,但其具體機(jī)制尚不清楚。以往研究大多關(guān)注該過(guò)程黏附分子的表達(dá)情況,而對(duì)相關(guān)蛋白分子的蛋白質(zhì)翻譯后修飾對(duì)其影響的研究相對(duì)較少。故本課題將重點(diǎn)探討動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生早期糖基化修飾水平的改變以及β-Catenin的α-2,6唾液酸化作用與單核細(xì)胞穿透內(nèi)皮細(xì)胞的相關(guān)性及分子機(jī)制,從而揭示糖基轉(zhuǎn)移酶ST6Gal-?在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展及消退過(guò)程的表達(dá)規(guī)律及生物功能,為今后動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供新的思路。第一部分ST6Gal-Ⅰ參與動(dòng)脈粥樣硬化形成、進(jìn)展及消退過(guò)程ApoE~(-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化形成、進(jìn)展及消退過(guò)程與ST6Gal-Ⅰ基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?以ApoE~(-/-)小鼠為研究對(duì)象,高脂喂養(yǎng)小鼠構(gòu)建動(dòng)脈粥樣粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展及藥物干預(yù)消退模型,初步確定動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過(guò)程與唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ST6Gal-Ⅰ)的表達(dá)相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)方法:1.采用高脂喂養(yǎng)ApoE~(-/-)小鼠16周,構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生組(基線模型組,baseline)、高脂喂養(yǎng)23周(發(fā)展組,development)及高脂喂養(yǎng)23周同時(shí)后7周給予瑞舒伐他汀灌胃處理(消退組,regression)。2.常規(guī)生化分析血清中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)。3.油紅O檢測(cè)主動(dòng)脈根部斑塊面積大小。4.HE檢測(cè)主動(dòng)脈根部病理變化。5.免疫組化檢測(cè)主動(dòng)脈根部糖基轉(zhuǎn)移酶ST6Gal-Ⅰ的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.ApoE~(-/-)小鼠經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)后,動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展組與基線組相比,隨著高脂飼料喂養(yǎng)周數(shù)的增加,小鼠血清中LDL-C、HDL-C、TC、TG水平均升高,其中LDL-C及TG變化具有顯著性差異(P(27)0.05);消退組與發(fā)展組比較,LDL-C、TG水平均明顯下降,并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P(27)0.05)。血脂四項(xiàng)結(jié)果初步提示動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展及消退模型構(gòu)建成功。2.油紅O染色結(jié)果顯示,發(fā)展組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊面積大小明顯高于基線組(P(27)0.05),消退組明顯低于發(fā)展組(P(27)0.05)。各組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊面積大小結(jié)果進(jìn)一步提示動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展及消退模型構(gòu)建成功。3.HE染色顯示與基線組相比動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展組內(nèi)膜排列紊亂且異常增生,厚度明顯高于基線組(P(27)0.05),消退組明顯低于發(fā)展組(P(27)0.05)。表明動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展及消退模型構(gòu)建成功。4.動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展組內(nèi)膜ST6Gal-Ⅰ的表達(dá)明顯高于基線組,消退組ST6Gal-Ⅰ的表達(dá)較發(fā)展組出現(xiàn)明顯的回升。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展及消退過(guò)程可能與糖基轉(zhuǎn)移酶ST6Gal-Ⅰ表達(dá)密切相關(guān)。第二部分TNF-α通過(guò)ST6GAL-?影響內(nèi)皮細(xì)胞中功能蛋白唾液酸化,進(jìn)而影響單核穿透內(nèi)皮細(xì)胞的功能實(shí)驗(yàn)?zāi)康?以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926為研究對(duì)象,TNF-α刺激內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化炎癥損傷體外模型,分析在炎癥作用下內(nèi)皮細(xì)胞ST6Gal-Ⅰ表達(dá)及單核細(xì)胞穿透內(nèi)皮功能的變化。實(shí)驗(yàn)方法:1.采用臺(tái)盼藍(lán)染色法,驗(yàn)證TNF-α對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響。2.Western blot、免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TNF-α處理后,EA.hy926細(xì)胞中ST6Gal-Ⅰ及總蛋白的α-2,6唾液酸化水平的變化情況。3.單核-內(nèi)皮細(xì)胞transwell小室三維立體共培養(yǎng)驗(yàn)證TNF-α處理EA.hy926細(xì)胞后,單核細(xì)胞穿透內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。4.利用si RNA構(gòu)建ST6Gal-Ⅰ的瞬時(shí)干擾模型,WB及流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證模型是否構(gòu)建成功。5.ST6Gal-Ⅰ干擾后,驗(yàn)證單核穿透內(nèi)皮細(xì)胞功能變化。6.Western blot檢測(cè)TNF-α處理EA.hy926細(xì)胞對(duì)FAK信號(hào)通路的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.與對(duì)照組相比,TNF-α在0-50ng/ml濃度范圍處理EA.hy926對(duì)細(xì)胞的存活率基本無(wú)影響。2.與對(duì)照組相比,TNF-α處理EA.hy926細(xì)胞后,WB結(jié)果顯示細(xì)胞中ST6Gal-Ⅰ表達(dá)水平均明顯下降,SNA-blot結(jié)果顯示,細(xì)胞中總唾液酸化蛋白均呈下降趨勢(shì),且在10-20ng/ml具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P(27)0.05)。免疫熒光及流式的結(jié)果均顯示TNF-α刺激EA.hy926細(xì)胞后,細(xì)胞表面SNA標(biāo)志蛋白明顯下降。3.在transwell小室共培養(yǎng)單核-內(nèi)皮細(xì)胞模型中,與對(duì)照組相比,隨著TNF-α濃度的升高,熒光標(biāo)記的單核細(xì)胞穿透內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量逐漸增多,酶標(biāo)儀檢測(cè)下槽的熒光強(qiáng)度值也是逐漸增強(qiáng)的(P(27)0.05),表明單核細(xì)胞穿透內(nèi)皮細(xì)胞功能明顯增強(qiáng)。4.si RNA干擾后,細(xì)胞中ST6Gal-?、SNA標(biāo)志蛋白表達(dá)及流式檢測(cè)細(xì)胞表面SNA標(biāo)志蛋白水平均明顯低于對(duì)照組(P(27)0.05)。且單核細(xì)胞穿透內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量明顯增多,transwell下室單核細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(P(27)0.05)5.Western blot檢測(cè)顯示,TNF-α處理EA.hy926細(xì)胞FAK磷酸化水平明顯上升。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:TNF-α誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞ST6Gal-?及總蛋白的α-2,6唾液酸化水平明顯下降,且單核穿透內(nèi)皮細(xì)胞的功能明顯增強(qiáng),即內(nèi)皮細(xì)胞遭到破壞。第三部分ST6Gal-?調(diào)控β-Catenin唾液酸化的分子機(jī)制實(shí)驗(yàn)?zāi)康?以EA.hy926為研究對(duì)象,TNF-α刺激內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化炎癥損傷體外模型,分析在炎癥作用下與緊密連接相關(guān)的蛋白是否發(fā)生α-2,6唾液酸化及細(xì)胞之間緊密連接的變化。實(shí)驗(yàn)方法:1.采用免疫共沉淀及免疫印跡法,驗(yàn)證TNF-α對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白的α-2,6唾液酸化的影響。2.免疫熒光進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞膜表面靶蛋白β-catenin的α-2,6唾液酸化水平。3.電鏡觀察正常組、炎癥刺激組及過(guò)表達(dá)ST6Gal-?炎癥刺激組細(xì)胞與細(xì)胞之間緊密連接的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.IP結(jié)果顯示,炎癥刺激前后Integrinα5、N-Cadherin、p-β-Catenin和β-Catennin本身的表達(dá)量并未發(fā)生明顯變化,Integrinα5和N-Cadherin的α-2,6唾液酸化水平也未發(fā)生改變,而p-β-Catenin和β-Catennin的α-2,6唾液酸化水平相對(duì)于對(duì)照組明顯下降。2.免疫熒光結(jié)果顯示,炎癥刺激內(nèi)皮后,細(xì)胞膜表面p-β-Catenin的完整性遭到破壞。3.電鏡結(jié)果顯示,對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞間連接緊密,炎癥刺激后,內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接變得松散,緊密連接結(jié)構(gòu)遭到了破壞,而在過(guò)表達(dá)ST6Gal-?同時(shí)給予炎癥刺激時(shí),與炎癥組相比,細(xì)胞之間的緊密連接出現(xiàn)了明顯的回復(fù)現(xiàn)象,細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接變得緊密了。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:EA.hy926細(xì)胞與細(xì)胞之間緊密連接的變化可能是由ST6Gal-?催化β-Catenin的α-2,6唾液酸化引起的。
[Abstract]:This study focused on the changes of atherosclerotic formation , progression and regression , and the mechanism of molecular mechanism . The results showed that the changes of the early glycosylation modification level of atherosclerosis and the expression of 偽 - 2,6 Sialic acid and the mechanism of molecular mechanism were studied .
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R543.5

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本文編號(hào)：2011968