本文選題：慢性間歇性低壓低氧 + 肺動脈高壓��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：肺動脈高壓(Pulmonary artery hypertension,PAH)以肺動脈壓力升高為主要特征,其基本病理改變是肺血管舒縮功能的改變和肺血管重構(gòu)。近年來,有關(guān)肺動脈高壓發(fā)病機(jī)制、治療策略的研究和開發(fā)逐漸成為基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)共同關(guān)注的熱點(diǎn)。流行病學(xué)資料顯示:高原動物和世居人較平原動物和人對缺氧環(huán)境具有更強(qiáng)的適應(yīng)能力,這種現(xiàn)象的重要原因之一就是其肺血管對缺氧的收縮反應(yīng)較弱,此即高原缺氧適應(yīng)—習(xí)服機(jī)制之肺血管低反應(yīng)性機(jī)制。由此,我們考慮,適度缺氧適應(yīng)可能在某種程度上對于以肺血管舒縮功能改變?yōu)橹饕±砩硖卣髦坏姆蝿用}高壓具有一定的遏制作用。慢性間歇性低壓低氧(Chronic intermittent hypobaric hypoxia,CIHH)指人或動物在一定時間內(nèi)間斷暴露于低壓低氧環(huán)境內(nèi)(模擬高原環(huán)境低氧),而其余時間暴露于常氧環(huán)境。已有研究表明CIHH對包括心血管系統(tǒng)在內(nèi)的機(jī)體的多種組織、器官具有保護(hù)作用,并表現(xiàn)抗高血壓效應(yīng),但目前尚無CIHH對PAH作用的研究報道。本研究以野百合堿(Monocrotaline,MCT)誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓為模型觀察CIHH對肺動脈高壓的預(yù)防作用,并通過微血管張力測定、免疫組化、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)、ELISA、Western blot和q PCR等方法從整體、器官、組織、細(xì)胞、分子和基因水平探討CIHH預(yù)防MCT誘導(dǎo)肺動脈高壓的可能機(jī)制,以驗證我們的假說:CIHH可通過增強(qiáng)肺小動脈舒張發(fā)揮預(yù)防PAH作用。本研究分為三部分:(1)導(dǎo)管法測定肺血流動力學(xué)指標(biāo),觀察CIHH對MCT誘導(dǎo)性PAH的預(yù)防作用;光鏡觀察肺組織和肺小動脈結(jié)構(gòu)改變。(2)微血管張力測定法明確CIHH對大鼠肺小動脈舒縮活動的影響;檢測e NOS和CYP2J2表達(dá)的變化,探討CIHH對肺小動脈內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響;檢測血管平滑肌BKCa通道表達(dá)的變化,探討CIHH對肺小動脈非內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響;檢測ki-67和ɑ-SM-actin表達(dá)的變化,探討CIHH對肺小動脈平滑肌細(xì)胞增殖和表型轉(zhuǎn)換進(jìn)而對其收縮功能的影響。(3)ELISA法檢測血清TNF-ɑ、IL-6及Western blot和q PCR法檢測肺組織TNF-ɑ、IL-6表達(dá)的變化,流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞以及脾臟CD3+T淋巴細(xì)胞凋亡率的變化,探討CIHH對MCT誘導(dǎo)PAH預(yù)防作用的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制;檢測p-P38/p38MAPK、P65/Ik Bɑ表達(dá)的變化探討CIHH對MCT誘導(dǎo)PAH預(yù)防作用的p38MAPK信號通路和NF-кB信號通路機(jī)制。第一部分慢性間歇性低壓低氧對野百合堿誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓的預(yù)防作用目的:明確CIHH對MCT誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓的預(yù)防作用。方法:大鼠隨機(jī)分為四組:正常對照組(CON)、肺動脈高壓組(PAH)、間歇性低壓低氧處理組(CIHH)、間歇性低壓低氧預(yù)處理+肺動脈高壓組(CIHH+MCT)。CIHH組大鼠置于低壓低氧艙中,接受相當(dāng)于海拔5000m高度、28天、每天6小時的低壓低氧處理,其余時間置于常氧環(huán)境。PAH組大鼠單劑量腹腔注射MCT(60 mg/kg)14天后造成PAH模型。CIHH+MCT組接受28天的CIHH處理后單劑量腹腔注射MCT(60mg/kg),14天后進(jìn)行實驗。每周定時測量各組動物的體重和血壓。導(dǎo)管法測定肺血流動力學(xué)指標(biāo),光鏡下觀察肺組織和肺小動脈結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果:1.CIHH處理對正常大鼠基礎(chǔ)血壓、心率和體重?zé)o影響(P0.05),但可對抗PAH大鼠心率的加快和體重的降低(P0.05)。2.與CON組大鼠相比,PAH組大鼠m PAP顯著升高(P0.01);CIHH組、CIHH+MCT組大鼠m PAP與CON組大鼠無顯著差異(P0.05)。3.PAH組大鼠右心室肥厚指數(shù)(RVHI)明顯高于其他三組大鼠(P0.01);CON組、CIHH組、CIHH+MCT組大鼠之間RVHI無顯著性差異(P0.05)。4.組織切片光鏡下可見,CIHH組和CON組大鼠肺動脈管壁結(jié)構(gòu)清楚,厚度正常;PAH組大鼠肺小動脈管壁明顯增厚,血管管腔狹窄甚至閉塞;CIHH+MCT組大鼠肺小動脈僅輕度增厚,程度明顯輕于PAH組大鼠,血管管腔也無明顯狹窄。CON組和CIHH組大鼠肺組織和肺血管周圍無明顯炎癥細(xì)胞浸潤;PAH組大鼠肺泡腔內(nèi)巨噬細(xì)胞明顯增多,肺小動脈周圍單核/巨噬細(xì)胞浸潤明顯增多,血管周圍炎癥評分明顯升高;而CIHH+MCT組大鼠肺泡腔內(nèi)、肺小動脈周圍單核/巨噬細(xì)胞明顯少于PAH組大鼠,血管周圍炎癥評分亦明顯偏低。與CON組大鼠相比較,PAH組大鼠肺動脈管壁厚度(MT%)顯著增加(P0.01),管腔面積(VA%)明顯減小(P0.01);CIHH+MCT組大鼠MT%較PAH組大鼠明顯降低(P0.01)而VA%明顯升高(P0.01)。小結(jié):1.CIHH預(yù)處理能有效預(yù)防MCT誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓的產(chǎn)生,改善右室肥厚程度及肺小動脈重構(gòu);2.CIHH預(yù)處理對MCT誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓的預(yù)防作用可能與其抑制肺血管重構(gòu)和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。第二部分慢性間歇性低壓低氧對野百合堿誘導(dǎo)肺動脈高壓大鼠肺動脈舒縮活動的影響目的:明確CIHH對MCT誘導(dǎo)肺動脈高壓大鼠肺動脈收縮和舒張的影響并探討其機(jī)制。方法:大鼠隨機(jī)分為四組:正常對照組(CON)、肺動脈高壓組(PAH)、間歇性低壓低氧處理組(CIHH)、間歇性低壓低氧預(yù)處理+肺動脈高壓組(CIHH+MCT)。CIHH組大鼠置于低壓低氧艙中,接受相當(dāng)于海拔5000 m高度、28天、每天6小時的低壓低氧處理,其余時間置于常氧環(huán)境。PAH組大鼠單劑量腹腔注射MCT(60 mg/kg)14天后造成PAH模型。CIHH+MCT組接受28天的CIHH處理后單劑量腹腔注射MCT(60mg/kg),14天后進(jìn)行實驗。每周定時測量各組動物的體重和血壓。利用微血管環(huán)張力測定法分別觀察PE誘導(dǎo)的肺動脈環(huán)收縮、ACh誘導(dǎo)的肺動脈內(nèi)皮依賴性舒張和SNP誘導(dǎo)的肺動脈非內(nèi)皮依賴性舒張。采用Western blot和q PCR方法檢測肺動脈e NOS和CYP2J2表達(dá)的變化,探討CIHH對肺動脈內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響;采用Western blot和q PCR方法檢測血管平滑機(jī)BKCa通道表達(dá)的變化,探討CIHH對肺動脈非內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響;采用免疫熒光方法檢測肺動脈ki-67表達(dá)的變化,采用Western blot和q PCR方法檢測肺動脈ɑ-SM-actin表達(dá)的變化,觀察CIHH對肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖和表型轉(zhuǎn)換的改變進(jìn)而探討對其收縮功能的影響。結(jié)果:1.與CON組大鼠相比較,PAH組大鼠肺小動脈環(huán)內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)降低(P0.05),CIHH預(yù)處理可增加肺小動脈內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)(P0.05),并預(yù)防大鼠肺小動脈內(nèi)皮依賴性舒張的降低(P0.05)。2.與CON組大鼠相比較,PAH組大鼠肺小動脈環(huán)非內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)降低(P0.05),CIHH預(yù)處理可增加肺小動脈非內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)(P0.05),并預(yù)防大鼠肺小動脈非內(nèi)皮依賴性舒張的降低(P0.05)。3.與CON組大鼠相比較,PAH組大鼠肺小動脈環(huán)對PE反應(yīng)性降低、收縮減弱(P0.05);CIHH預(yù)處理可提高大鼠肺動脈對PE的收縮反應(yīng),對抗PAH大鼠肺動脈對PE收縮的減弱反應(yīng)(P0.05)。4.與CON組大鼠相比較:PAH組大鼠肺小動脈e NOS和CYP2J2表達(dá)下調(diào)(P0.05),CIHH組大鼠e NOS和CYP2J2表達(dá)明顯上調(diào)(P0.01),CIHH預(yù)處理(CIHH+MCT組)可預(yù)防大鼠肺小動脈e NOS和CYP2J2下調(diào)(P0.05)。5.與CON組大鼠相比較:PAH組大鼠肺小動脈ɑ-SM-actin和BKCa通道表達(dá)下調(diào)(P0.05),CIHH組大鼠ɑ-SM-actin和BKCa通道表達(dá)上調(diào)(P0.05),CIHH預(yù)處理(CIHH+MCT組)可預(yù)防大鼠肺小動脈ɑ-SM-actin和BKCa通道下調(diào)(P0.05)。6.與CON組大鼠相比較:PAH組大鼠肺小動脈ki-67表達(dá)上調(diào)(P0.05),CIHH預(yù)處理(CIHH+MCT組)可預(yù)防大鼠肺小動脈ki-67上調(diào)(P0.01)。小結(jié):1.CIHH預(yù)處理對MCT誘導(dǎo)性大鼠肺動脈高壓的預(yù)防作用可能通過增強(qiáng)內(nèi)皮依賴性和非內(nèi)皮依賴性舒張、調(diào)節(jié)肺小動脈收縮所實現(xiàn)。2.CIHH預(yù)處理可能通過上調(diào)大鼠肺小動脈e NOS和CYP2J2表達(dá),增強(qiáng)肺小動脈環(huán)內(nèi)皮依賴性舒張。3.CIHH預(yù)處理可能通過上調(diào)大鼠肺小動脈血管平滑肌細(xì)胞BKCa通道表達(dá),增強(qiáng)肺小動脈環(huán)非內(nèi)皮依賴性舒張。4.CIHH預(yù)處理可上調(diào)ɑ-SM-actin表達(dá),下調(diào)ki-67表達(dá),從而可能通過抑制大鼠肺小動脈平滑肌細(xì)胞增殖和表型轉(zhuǎn)換、調(diào)節(jié)肺小動脈環(huán)收縮功能。第三部分慢性間歇性低壓低氧對野百合堿誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓預(yù)防作用的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制目的:探討CIHH對MCT誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓預(yù)防作用的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。方法:大鼠隨機(jī)分為四組:正常對照組(CON)、肺動脈高壓組(PAH)、間歇性低壓低氧處理組(CIHH)、間歇性低壓低氧預(yù)處理+肺動脈高壓組(CIHH+MCT)。CIHH組大鼠置于低壓低氧艙中,接受相當(dāng)于海拔5000m高度、28天、每天6小時的低壓低氧處理,其余時間置于常氧環(huán)境。PAH組大鼠單劑量腹腔注射MCT(60 mg/kg)14天后造成PAH模型。CIHH+MCT組接受28天的CIHH處理后單劑量腹腔注射MCT(60mg/kg),14天后進(jìn)行實驗。每周定時測量各組動物的體重和血壓。采用ELISA和免疫組化方法檢測血清和肺組織TNF-ɑ、IL-6表達(dá)的變化,采用流式細(xì)胞術(shù)測定外周血CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值以及脾臟CD3+T淋巴細(xì)胞凋亡率的變化;采用Western blot和q PCR方法從蛋白和基因水平檢測p-P38/p38MAPK、p-P65/Ik Bɑ表達(dá)的變化,探討CIHH對MCT誘導(dǎo)性大鼠肺動脈高壓預(yù)防作用的信號通路機(jī)制。結(jié)果:1.與CON組大鼠相比較:PAH組大鼠外周血和肺組織TNF-ɑ、IL-6表達(dá)明顯上調(diào)(P0.01),CIHH預(yù)處理(CIHH+MCT組)可預(yù)防大鼠MCT誘導(dǎo)性TNF-ɑ、IL-6表達(dá)上調(diào)(P0.01)。2.與CON組大鼠相比較:PAH組大鼠外周血CD4+T淋巴細(xì)胞水平明顯升高、CD8+T淋巴細(xì)胞水平明顯下降、CD4+/CD8+比值升高(P0.05),脾臟CD3+T淋巴細(xì)胞凋亡率明顯下降(P0.01);CIHH組大鼠外周血CD4+T淋巴細(xì)胞水平下降、CD8+T淋巴細(xì)胞水平升高、CD4+/CD8+比值下降(P0.01),脾臟CD3+T淋巴細(xì)胞凋亡率明顯升高(P0.01);CIHH預(yù)處理(CIHH+MCT組)可預(yù)防大鼠MCT誘導(dǎo)性CD4+升高、CD8+下降、CD4+/CD8+比值升高以及脾臟CD3+T淋巴細(xì)胞凋亡率下降(P0.01)。3.與CON組大鼠相比較:PAH組大鼠肺組織p-P38表達(dá)明顯上調(diào)、p38MAPK表達(dá)上調(diào)、p-P38/p38MAPK比值升高(P0.01);CIHH組大鼠肺組織p-P38表達(dá)明顯下調(diào)、p38MAPK表達(dá)下調(diào)、p-P38/p38MAPK比值降低(P0.01);CIHH預(yù)處理(CIHH+MCT組)可預(yù)防大鼠MCT誘導(dǎo)性p-P38表達(dá)上調(diào)從而抑制p-P38/p38MAPK比值升高(P0.01)。4.與CON組大鼠相比較:PAH組大鼠肺組織P65表達(dá)明顯上調(diào)、Ik Bɑ表達(dá)明顯下調(diào)、P65/Ik Bɑ比值升高(P0.01);CIHH組大鼠血清P65表達(dá)明顯下調(diào)、Ik Bɑ表達(dá)明顯上調(diào)、P65/Ik Bɑ比值降低(P0.01);CIHH預(yù)處理(CIHH+MCT組)可預(yù)防大鼠MCT誘導(dǎo)性P65表達(dá)上調(diào)、Ik Bɑ表達(dá)下調(diào)從而抑制P65/Ik Bɑ比值降低(P0.01)。小結(jié):1.CIHH預(yù)處理對MCT誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓的預(yù)防作用可能與其抑制促炎因子TNF-ɑ、IL-6的產(chǎn)生和表達(dá)有關(guān)。2.CIHH預(yù)處理對MCT誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓的預(yù)防作用可能與其維持T淋巴細(xì)胞增殖/凋亡平衡、抑制CD4+/CD8+亞群比例失調(diào)有關(guān)。3.CIHH預(yù)處理之抗MCT誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓的免疫調(diào)節(jié)作用可能通其抑制p38MAPK信號通路和NF-кB信號通路的過度激活而實現(xiàn)。結(jié)論1.CIHH預(yù)處理對MCT誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓具有明顯的預(yù)防作用,此預(yù)防作用可能與其抑制肺小動脈重構(gòu)和免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。2.CIHH預(yù)處理可通過上調(diào)肺小動脈e NOS、CYP2J2及平滑肌細(xì)胞BKCa通道表達(dá),增強(qiáng)肺小動脈內(nèi)皮依賴和內(nèi)皮非依賴舒張、對抗PAH大鼠肺小動脈舒張功能降低,預(yù)防肺動脈高壓。3.CIHH預(yù)處理可通過下調(diào)ki-67表達(dá)和上調(diào)ɑ-SM-actin表達(dá),抑制血管平滑肌病理性增殖和表型轉(zhuǎn)換,預(yù)防肺動脈高壓。4.CIHH預(yù)處理可通過p38MAPK信號通路和NF-кB信號通路抑制PAH大鼠肺小動脈促炎細(xì)胞因子升高、改善T淋巴細(xì)胞增殖/凋亡比例和CD4+/CD8+亞群比例失調(diào),預(yù)防肺動脈高壓。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R544.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1965145