本文選題：心臟祖細(xì)胞 + c-kit��； 參考：《東南大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：第一部分心臟祖細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)和純化目的優(yōu)化培養(yǎng)條件,探索從成年小鼠心臟組織中的分離培養(yǎng)和純化c-kit(+)心臟祖細(xì)胞(cardiac progenitor cells, CPCs)的有效方法。方法嚴(yán)格無菌條件下取2月齡成年C57BL/6小鼠心臟,剪成1mm3大小,經(jīng)0.1%膠原酶Ⅳ和0.25%胰蛋白酶充分消化后,加入組織塊培養(yǎng)基(complete explant medium,CEM)貼壁培養(yǎng)。2周后,Accutase酶輕柔消化心肌組織塊周圍的“小、圓、亮”細(xì)胞,移入心球生長培養(yǎng)基(cardiosphere-growing medium, CGM)繼續(xù)培養(yǎng)。待擴增培養(yǎng)充分后,采用免疫磁珠篩選法獲得純化的c-kit(+) CPCs,顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點,流式細(xì)胞儀分析所得細(xì)胞表面標(biāo)記c-kit、Scal-1、CD34、CD45的表達(dá)。結(jié)果心肌組織經(jīng)充分消化貼壁培養(yǎng)后,約1周可見組織塊周圍出現(xiàn)大量成纖維樣細(xì)胞,約2周可見大量“小、圓、亮”細(xì)胞附著在成纖維樣細(xì)胞層上。顯微鏡下可見經(jīng)磁珠篩選后的細(xì)胞呈克隆樣擴增。流式細(xì)胞學(xué)分析顯示篩選后的CPCs表面標(biāo)記c-kit陽性率達(dá)80.17%±5.32%,Sca1-1陽性率為40.37%±4.61%,而CD34陽性率為1.77%±0.08%,CD45陽性率為1.22%±0.21%。結(jié)論通過酶消化成年小鼠的心肌組織及磁珠分選純化,可以方便、穩(wěn)定的獲得高純度的c-kit(+)CPCs,滿足了后續(xù)實驗的細(xì)胞需求。第二部分缺氧預(yù)適應(yīng)對心臟祖細(xì)胞抗凋亡作用的影響目的觀察缺氧預(yù)適應(yīng)對c-kit(+)CPCs抗凋亡作用的影響,并初步探討缺氧預(yù)適應(yīng)影響CPCs抗凋亡的可能機制。方法將c-kit(+)CPCs預(yù)先置于正常氧(H0)或缺氧環(huán)境(0.1%O25%CO294.9%N2)分別培養(yǎng)6小時(H6)后,再置于無糖無血清培養(yǎng)基和缺氧環(huán)境下(0.1%O2 5%CO2 94.9%N2)培養(yǎng)24小時(24h),用流式細(xì)胞儀Annexin-V/碘化吡啶(PI)雙染色法檢測細(xì)胞凋亡和MTT法分析細(xì)胞增殖情況。給予急性心肌梗死模型小鼠心肌內(nèi)注射經(jīng)缺氧預(yù)適應(yīng)處理的CPCs,術(shù)后7天經(jīng)胸壁小動物心臟超聲檢測小鼠心功能,術(shù)后28天處死小鼠后取心臟標(biāo)本行Masson染色觀察心臟纖維化面積。用WB (western blot)檢測CPCs經(jīng)缺氧預(yù)適應(yīng)處理后Akt蛋白表達(dá)水平。結(jié)果缺氧預(yù)適應(yīng)組(H6組)凋亡率(15.05%±1.54%)顯著低于正常氧培養(yǎng)組(H0 組)(28.82%±±1.43%)(P0.05)。其作用被 PI3K 阻斷劑 LY294002 阻斷(H6+24h+LY 組:凋亡率 31.07±1.44%) (P 0.01);而H0組加入胰島素樣生長因子-1 (IGF-1,PI3K激動劑)后,其凋亡率顯著下降(H0+24h+IGF 組:17.26±2.13%) (P0.05)。MTT 實驗顯示 H6 組細(xì)胞存活率顯著高于HO (P 0.01)。MTT實驗顯示缺氧預(yù)適應(yīng)促進CPCs存活的效應(yīng),同樣可被LY294002阻斷,而被IGF-1激活。心臟彩超結(jié)果顯示,H6組心功能及心臟重構(gòu)改善,左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS)均顯著高于H0組和PBS組(P0.05);而H6組的左室舒張末容積(LVEDD)和左室收縮末容積(LVESD)均顯著小于H0組和PBS組(P0.05)。Masson染色結(jié)果表明:H6組小鼠心梗后心臟纖維化面積(29.4%±2.13%)明顯低于H0組(40.3%±4.28%)(P0.05),而H6組和H0組心臟纖維化面積明顯低于PBS組(49.2%±5.64%) (P0.05),說明移植經(jīng)缺氧預(yù)適應(yīng)處理的CPCs可顯著縮小小鼠心梗面積。WB結(jié)果顯示:H6組磷酸化Akt (p-Akt)表達(dá)水平較對照組顯著增高(p0.01); LY294002可阻斷其作用,而IGF-1可促進其作用。結(jié)論缺氧預(yù)適應(yīng)可以促進CPCs抗凋亡能力,并且這一細(xì)胞保護效應(yīng)可能是經(jīng)由PI3K/Akt信號通路發(fā)揮作用的。第三部分DNMT1介導(dǎo)的缺氧預(yù)適應(yīng)調(diào)控p53的機制研究目的觀察缺氧預(yù)適應(yīng)通過PI3K/Akt通路對DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)和p53進行調(diào)控的機制,并探討DNMT1與p53之間的關(guān)系。觀察DNMT1甲基化催化活性對p53的影響,并進一步在轉(zhuǎn)錄水平上明確DNMT1對p53的調(diào)控機制。方法將c-kit(+ CPCs預(yù)先置于正常氧或缺氧環(huán)境(0.1%O2 5%C02 94.9%N2)分別培養(yǎng)6小時后,再置于無糖無血清培養(yǎng)基和缺氧環(huán)境下(0.1%O25%CO294.9%N2)培養(yǎng)24小時。采用WB檢測CPCs經(jīng)缺氧預(yù)適應(yīng)處理后Akt、DNMTs和p53蛋白表達(dá)變化;采用q-PCR (real-time quantitative PCR)檢測DNMTs、p53的mRNA表達(dá)水平。用siRNA靶向沉默DNMT1,并用5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-azadc)阻斷DNMT1的甲基化催化活性,然后用WB檢測p53蛋白的表達(dá)。查詢p53啟動子區(qū)0至-2000 bp區(qū)域內(nèi)CpG島的分布情況,通過亞硫酸氫鹽測序法(Bisulfite genomic sequence, BSP)檢測該區(qū)域所有CpG島CpG位點的甲基化狀態(tài);克隆p53啟動子區(qū)+157至-2150 bp基因序列從而構(gòu)建兩種報告基因質(zhì)粒(野生組p53 promoter和突變組p53 promoter (M)),并采用雙熒光素酶實驗檢驗DNMT1對p53的調(diào)控;采用ChIP實驗檢驗DNMT1是否與p53啟動子區(qū)直接結(jié)合。結(jié)果H6+24h組DNMT1和DNMT3β蛋白表達(dá)顯著升高(p0.01),而p53蛋白表達(dá)顯著下降(p0.01);LY294002可阻斷其作用,而IGF-1可促進其作用。但DNMT3α則在各組間無顯著變化(p0.05)。缺氧預(yù)適應(yīng)顯著提高了 DNMT1、DNMT3β的mRNA表達(dá)水平(p0.01),并抑制了 p53 的 mRNA 表達(dá)水平(p0.01 )。DNMT1 被 siRNA 靶向沉默后,p53的表達(dá)顯著提高(p0.05);而DNMT1的甲基催化活性被阻斷后,p53的表達(dá)水平同樣有顯著性提高(p0.05);當(dāng)同時干擾沉默DNMT1和阻斷其甲基催化活性,p53表達(dá)則被顯著激活(p0.01),與單純沉默DNMT1或阻斷其催化活性相比,p53表達(dá)量升高但無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。p53啟動子區(qū)共分布有3個CpG島,H6+24h組p53啟動子區(qū)所有3個CpG島甲基化水平與對照組比較,均未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05);雙熒光素酶實驗顯示,H6+24h組相對熒光強度要顯著低于H0+24h組(p0.01 ),并且其在p53 promoter組要顯著低于p53 promoter (M)組(p0.01); ChIP實驗顯示,缺氧預(yù)適應(yīng)組可擴增出與DNMT1抗體相結(jié)合的染色質(zhì)片段。結(jié)論缺氧預(yù)適應(yīng)可能經(jīng)由PI3K/Akt信號通路上調(diào)DNMT1和DNMT3β、抑制p53的表達(dá),并且p53受DNMT1的反向調(diào)控。DNMT1可能不是通過影響p53啟動子區(qū)甲基化水平,而是作為轉(zhuǎn)錄因子直接與p53啟動子區(qū)特定位點相結(jié)合來抑制p53的表達(dá)。
[Abstract]:The expression of c - kit ( + ) CPCs in adult mouse heart was studied . The positive rate of c - kit ( + ) CPCs was detected by flow cytometry . The positive rate of c - kit ( + ) CPCs was detected by flow cytometry . Results The apoptosis rate of hypoxic preconditioning group was significantly lower than that of normal oxygen culture group ( 28.82 % 鹵 1.43 % ) ( P 0.01 ) . The apoptosis rate of hypoxic preconditioning group ( group H 6 + 24h + LY group : 17.26 鹵 2.13 % ) was significantly lower than that in normal oxygen culture group ( P 0.01 ) . The effects of hypoxia preconditioning on DNA methyltransferase ( DNMTs ) and p53 protein expression were observed . However , there was no significant change in the expression of p53 protein ( p0.01 ) . However , there was no significant change in the expression of DNMT3偽 ( p < 0.05 ) . The expression level of DNMT3尾 mRNA was significantly increased ( p0.01 ) in hypoxia preconditioning , and the level of p53 mRNA expression was inhibited ( p0.01 ) . Compared with the control group , the expression level of p53 was significantly higher than that in the control group ( p < 0.05 ) , and the expression of p53 was significantly lower than that in the control group ( p < 0.01 ) .
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R541

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本文編號：1962853