本文選題：抗凝血酶 + 組織因子途徑抑制物�。� 參考：《華中科技大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：第一部分抗凝血酶基因變異與靜脈血栓的關(guān)聯(lián)研究目的：研究抗凝血酶基因多態(tài)性(SERPINC1)與靜脈血栓的關(guān)聯(lián)及其致病的潛在的分子遺傳學(xué)機(jī)制。方法和結(jié)果：隨機(jī)選擇60例年齡不大于65歲及無蛋白C、蛋白S缺乏的非急性期VTE患者,對其SERPINC1基因啟動子區(qū)域、編碼區(qū)及側(cè)翼序列進(jìn)行重測序,在兩位VTE患者基因組DNA中新發(fā)現(xiàn)了位于5'非翻譯區(qū)的同一雜合突變c.-11GA(rs483352843)。對該變異進(jìn)行大樣本(1760例病例 VS 2200例對照)的酶切分型分析顯示,c.-11GA突變顯著增加攜帶者患靜脈血栓的風(fēng)險(0R=6.91; 95% CI:1.53-31.22;P=0.0035)。雜合突變攜帶者的抗凝血酶平均活性及抗原的平均水平分別為對照的78.4%(P0.0001)及88.9%(P=0.0004)。構(gòu)建野生型及突變型螢光素酶表達(dá)載體,分別轉(zhuǎn)染HEK-293T和COS-7細(xì)胞,突變型表達(dá)載體在HEK-293T和COS-7細(xì)胞中表達(dá)的雙熒光素酶活性分別為野生型的62.9%(P=0.006)和53.1%(P=0.004)。提取外周血細(xì)胞及上述兩種培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA做實時定量PCR顯示,突變型mRNA表達(dá)量分別為野生型的35.8%(P=0.026)、57.1%(P=0.010)及52.8%(P=0.004)。凝膠遷移實驗(EMSA)顯示突變型探針與DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合明顯強(qiáng)于野生型探針。結(jié)論：SERPINC1基因5'非翻譯區(qū)-11位的G堿基突變?yōu)锳堿基后,突變后的DNA與轉(zhuǎn)錄抑制因子的結(jié)合顯著增加,從而抑制了抗凝血酶基因的轉(zhuǎn)錄,使突變攜帶者體內(nèi)抗凝血酶的量顯著降低,導(dǎo)致攜帶者患VTE的風(fēng)險顯著增加。第二部分TFPI及ADTRP基因多態(tài)性與靜脈血栓的關(guān)聯(lián)研究目的：研究組織因子途徑抑制物(TFPI)及雄激素依賴的TFPI調(diào)節(jié)蛋白(ADTRP)基因可能存在的變異與靜脈血栓的關(guān)聯(lián)。方法與結(jié)果：隨機(jī)挑選176例年齡不超過65歲的無抗凝血酶、蛋白C及蛋白S缺乏的VTE患者,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血漿中TFPI抗原濃度,以來自100例健康體檢者的混合血漿作為參照,挑選出TFPI抗原濃度低于混合血漿TFPI抗原濃度50%的VTE患者48例。對這部分患者的TFPI, ADTRP基因重測序,分別發(fā)現(xiàn)了10種TFPI基因突變及11種ADTRP基因突變,其中位于ADTRP基因上c.154-18delT突變?yōu)槭状螆蟮�。對TFPI c.662AG (rs7586970)及ADTRP c.154-18delT突變進(jìn)行大樣本(901例病例vs 799例對照)基因分型分析結(jié)果顯示,c.662AG及c.154-18delT均不是VTE的危險因素,其OR值分別為0.85 (95% CI; 0.71-1.03; P= 0.106)及1.07(95% CI；0.998-1.14：P=0.058)。結(jié)論：在中國漢族人群中,TFPI基因上目前尚未發(fā)現(xiàn)增加攜帶者患VTE的風(fēng)險的變異,而ADTRP上c.154-18delT多態(tài)性位點可能是VTE的危險因素,該結(jié)論有待進(jìn)一步研究驗證。第三部分血栓調(diào)節(jié)蛋白基因變異在血栓性疾病中的作用的分子遺傳學(xué)研究目的：研究血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin, TM)基因(THBD)罕見突變在血栓性疾病中作用的可能的分子遺傳學(xué)機(jī)制。方法與結(jié)果：通過基因測序,在七位血栓性疾病患者的THBD基因中發(fā)現(xiàn)了7種新發(fā)突變：c.376GT (p.Asp126Tyr), c.569CG (p.Ser 190Trp), c.659TG (p.Leu220X), c.1208GA (p.Arg403Lys), c.1288GA (p.Gly430Ser), c.*6_*23del和c.*23_*40del.其中c.376GT和c.*6_*23del同時出現(xiàn)在一發(fā)病年齡為10歲的反復(fù)發(fā)作的深靜脈血栓(VTE)患者,該患者在隨訪一年后死亡；無義突變c.659TG在一55歲的女性心肌梗死(MI)患者及46歲的男性VTE患者中均被發(fā)現(xiàn),其中該男性VTE患者在隨訪兩年后死亡。酶聯(lián)免疫吸附試驗顯示這些突變攜帶者血漿游離TM抗原水平均比對照組低。通過體外細(xì)胞實驗,我們發(fā)現(xiàn)與野生型相比,有兩個點突變顯著降低了TM抗原的表達(dá)：Ser190Trp(71.2%±12.8%,P0.05),p.Leu220X(20.1%±10.4%,P0.01)；通過激活的PC水平判斷,與野生型比,四個點突變(c.569CG.c.659TG.c.1208GA和c.1288GA)均使TM的輔因子活性顯著降低。對于c.*6_*23de1和c.*23_*40del兩個18堿基缺失突變,雙熒光素酶報告基因表達(dá)水平均較野生型減低。結(jié)論：THBD基因上這7種變異都是有害突變,增加了攜帶者患血栓性疾病的風(fēng)險。
[Abstract]:Part 1 Association of antithrombin gene mutation with venous thrombosis: To study the association of antithrombin gene polymorphism (SERPINC1) with venous thrombosis and the underlying molecular genetic mechanism. Methods and results: a random selection of 60 non acute VTE patients with age 65 years old and no protein S and protein S deficiency were selected. The SERPINC1 gene promoter region, the coding region and the flanking sequence were re sequenced, and the same heterozygous mutation c.-11GA (rs483352843) was found in the 5'non translation region of the two VTE patients. A large sample of the mutation (1760 cases VS 2200 cases) showed that the c.-11GA mutation increased significantly. The risk of venous thrombosis (0R=6.91; 95% CI:1.53-31.22; P=0.0035). The average activity of antithrombin and the average level of antigen were 78.4% (P0.0001) and 88.9% (P=0.0004) in the heterozygous mutant carriers, respectively. The wild type and mutant fluoroenzyme expression vector was constructed, and HEK-293T and COS-7 cells were transfected respectively, and the mutant expression vectors were used. The activity of double luciferase expressed in HEK-293T and COS-7 cells were 62.9% (P=0.006) and 53.1% (P=0.004) in the wild type respectively. The real-time quantitative PCR of the extraction of peripheral blood cells and the total RNA of the above two cultured cells showed that the expression of mutant mRNA was 35.8% (P= 0.026), 57.1% (P=0.010) and 52.8% (P=0.004), respectively. EMSA) showed that the combination of the mutant probe and the DNA binding protein was stronger than the wild type probe. Conclusion: after the mutation of the G base of the -11 site of the SERPINC1 gene 5'to the A base, the binding of the mutant DNA to the transcriptional inhibitor increased significantly, thus inhibiting the transcription of the antithrombin gene and the amount of the antithrombin in the mutant carrier. A significant decrease, leading to a significant increase in the risk of carriers suffering from VTE. Second the association of TFPI and ADTRP gene polymorphisms with venous thrombosis: the study of the association of the possible mutations of the tissue factor pathway inhibitor (TFPI) and the androgen dependent TFPI regulatory protein (ADTRP) gene with the venous thrombosis. Methods and results: random selection 176 patients aged 65 years of age without antithrombin, protein C and protein S deficient VTE were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) to detect the concentration of TFPI antigen in plasma, and 48 cases of VTE patients with TFPI antigen concentration lower than the concentration of TFPI antigen of mixed plasma were selected and 48 cases of VTE patients were selected from the mixed plasma TFPI antigen concentration 50%. TFPI, ADTRP gene resequencing, 10 TFPI gene mutations and 11 ADTRP mutations were found, of which the c.154-18delT mutation located on the ADTRP gene was first reported. A large sample of TFPI c.662AG (rs7586970) and ADTRP c.154-18delT mutations (901 case vs 799 cases) 154-18delT was not a risk factor for VTE, and its OR values were 0.85 (95% CI; 0.71-1.03; P= 0.106) and 1.07 (95% CI; 0.998-1.14:P=0.058). Conclusion: in Chinese Han population, the risk of increasing VTE is not found in the TFPI gene, and ADTRP c.154-18delT polymorphic loci may be a risk factor. This conclusion needs further research and verification. Third the molecular genetic study of the role of thrombomodulin gene mutation in thrombotic diseases: Objective: To study the possible molecular genetic mechanism of the rare mutation of thrombomodulin (TM) gene (THBD) in thrombotic diseases. Methods and results: through the basis By sequencing, 7 new mutations were found in the THBD gene of seven patients with thrombotic disease: c.376GT (p.Asp126Tyr), c.569CG (p.Ser 190Trp), c.659TG (p.Leu220X), c.1208GA (p.Arg403Lys), c.1288GA (p.Gly430Ser), and simultaneously appeared at the age of 10. In patients with recurrent deep venous thrombosis (VTE), the patient died after a year of follow-up; nonsense mutation c.659TG was found in a 55 year old female myocardial infarction (MI) patient and a 46 year old male VTE. The male VTE patient died after two years of follow-up. The enzyme linked immunosorbent assay showed the free TM antigen of these mutant carriers. Compared with the control group, we found that two point mutations decreased the expression of TM antigen significantly compared with the wild type: Ser190Trp (71.2% + 12.8%, P0.05), p.Leu220X (20.1% + 10.4%, P0.01), and four point mutations (c.569CG.c.659TG.c.1208GA and c.1288GA), compared with the wild type, by the activation of PC level. The activity of the cofactor of TM was significantly reduced. For two 18 base deletion mutations in c.*6_*23de1 and c.*23_*40del, the expression level of the double luciferase reporter gene was lower than that of the wild type. Conclusion: the 7 mutations in the THBD gene are all harmful mutations, increasing the risk of thrombotic disease in the carrier.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R543

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本文編號：1954431