本文選題：TMEM16A + 肺動(dòng)脈高壓�。� 參考：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：目的：驗(yàn)證TMEM16A在大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上的表達(dá)及分布規(guī)律,探索可能由TMEM16A介導(dǎo)的CaCC的電生理學(xué)特點(diǎn)。方法：將SD大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組和分流組。通過腹主動(dòng)脈-下腔靜脈造瘺分流法建立高肺血流性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型,術(shù)后11周測(cè)定肺動(dòng)脈壓力。HE染色及免疫組化檢測(cè)TMEM16的分布；qRT-PCR檢測(cè)TMEM16A mRNA在各組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的表達(dá)水平：Western blot檢測(cè)TMEM16A蛋白的表達(dá)；全細(xì)胞膜片鉗記錄CaCC電生理學(xué)特點(diǎn)。結(jié)果：分流組大鼠肺動(dòng)脈壓力較正常組和假手術(shù)組顯著上升(P0.01),提示分流手術(shù)成功建立高肺血流性肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型。HE染色病理檢查可見分流組大鼠肺小動(dòng)脈管壁增厚、管腔狹窄。免疫組織化學(xué)染色顯示TMEM16A主要分布于肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜。qRT-PCR結(jié)果顯示,分流組TMEM16A mRNA表達(dá)水平較正常組和假手術(shù)組顯著增高(P0.01),而正常組和假手術(shù)組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。Western blot結(jié)果顯示,分流組TMEM16A蛋白表達(dá)水平較正常組和假手術(shù)組均顯著增高(P0.01),而正常組和假手術(shù)組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。通過全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞記錄到穩(wěn)定的CaCC電生理特征,其表現(xiàn)出外向整流性和Ca2+敏感性。分流組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的電流密度較正常組和假手術(shù)組顯著增高,I-V曲線上移(P0.01),而正常組和假手術(shù)組之間電流密度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論：(1)TMEM16A在高肺血流性肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上存在高表達(dá),可能參與了肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生過程。(2)高肺血流性肺動(dòng)脈高壓發(fā)生過程中,肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜上電流及電流密度增高,可能是肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生機(jī)制之一密度較正常組和假手術(shù)組顯著增高,I-V曲線上移(P0.01),而正常組和假手術(shù)組之間電流密度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。目的：為了進(jìn)一步探索高肺血流性肺動(dòng)脈高壓中TMEM16A是否調(diào)控肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上的CaCC及其電生理變化,我們通過構(gòu)建慢病毒載體、RNAi技術(shù)下調(diào)TMEM16A基因的表達(dá),從而為進(jìn)一步闡明TMEM16A在高肺血流性肺動(dòng)脈高壓中的作用奠定基礎(chǔ)。方法：根據(jù)第一部分建立的高肺血流性肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型,動(dòng)物分組、肺動(dòng)脈壓力測(cè)定、原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)均同第一部分。利用RNAi技術(shù),制備慢病毒載體后進(jìn)行慢病毒包裝,對(duì)特異性目的基因TMEM16A進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。通過qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)慢病毒對(duì)TMEM16A基因mRNA和蛋白的干擾效率。篩選出最高效率的干擾載體,通過qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后TMEM16A基因mRNA和蛋白表達(dá)量的變化。全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后電生理變化。結(jié)果：經(jīng)過慢病毒載體的制備、慢病毒包裝和細(xì)胞轉(zhuǎn)染等步驟,順利將帶有綠色熒光的慢病毒轉(zhuǎn)染至肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中。qRT-PCR和Western blot方法篩選出具有最高效率的干擾載體(83%)。對(duì)轉(zhuǎn)染前后各組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的TMEM16A mRNA表達(dá)量進(jìn)行比較,正常組、假手術(shù)組和分流組的表達(dá)量較各自轉(zhuǎn)染之前顯著下降(P0.01)。轉(zhuǎn)染前后各組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的TMEM16A蛋白表達(dá)量進(jìn)行比較,正常組、假手術(shù)組和分流組的表達(dá)量均較各自轉(zhuǎn)染之前顯著下降(P0.05)。正常組、假手術(shù)組和分流組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前后電流顯著下降,電流密度均較各自轉(zhuǎn)染之前顯著下降(P0.01)。轉(zhuǎn)染后分流組CaCC電流密度較轉(zhuǎn)染后正常組(P0.01)和假手術(shù)組(P0.05)均顯著增加,而轉(zhuǎn)染后正常組與轉(zhuǎn)染后假手術(shù)組CaCC電流密度之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論：(1) 成功構(gòu)建表達(dá)TMEM16A基因siRNA的慢病毒載體并篩選出具有較高干擾效率的RNA干擾載體。(2)經(jīng)RT-PCR和Western blot證實(shí),通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染方式有效降低TMEM16A mRNA和蛋白表達(dá),降低細(xì)胞膜電流及電流密度。(3)TMEM16A通過調(diào)控CaCC的方式參與高肺血流性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生。轉(zhuǎn)染前后電生理變化。目的：第二部分通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方式下調(diào)TMEM16A基因的表達(dá),為進(jìn)一步研究該基因在高肺血流性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生過程中的作用提供了重要的反向功能研究手段。因此我們繼續(xù)利用這一技術(shù)方法,探索TMEM16A對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖功能的影響及其可能作用的信號(hào)通路。方法：根據(jù)第一部分建立的高肺血流性肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型,動(dòng)物分組、肺動(dòng)脈壓力測(cè)定、原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)均同前述部分,以肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,利用第二部分建立的RNA干擾載體進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖變化,應(yīng)用Westernblot檢測(cè)PCNA、P-ERK、ERK蛋白的表達(dá)。結(jié)果：細(xì)胞接種后48小時(shí)后,肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞逐步進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,分流組增殖活性較正常組和假手術(shù)組明顯增高(P0.01),而正常組與假手術(shù)組之間無(wú)差異(P0.05)。各組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞進(jìn)行針對(duì)TMEM16A基因的轉(zhuǎn)染,敲低TMEM16A基因的各組細(xì)胞增殖速度均顯著下降(P0.01)。轉(zhuǎn)染前分流組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞PCNA表達(dá)量較正常組和假手術(shù)組顯著增高(P0.01),而正常組與假手術(shù)組之間無(wú)差異(P0.05)。比較轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞PCNA表達(dá)量的變化,敲低TMEM16A基因的各組細(xì)胞PCNA表達(dá)量均顯著下降(P0.01)。轉(zhuǎn)染前分流組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的P-ERK/ERK較正常組和假手術(shù)組顯著增高(P0.05),而正常組與假手術(shù)組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。比較轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞P-ERK/ERK變化,敲低TMEM16A基因的各組細(xì)胞P-ERK/ERK均顯著下降(P0.05)。結(jié)論：(1)TMEM16A促進(jìn)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖,從而參與高肺血流性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生。(2)TMEM16A促進(jìn)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖可能通過MAPK/ERK信號(hào)通路發(fā)揮作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R544.1

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 許琦;王悅;王建六;;鈣激活氯通道TMEM16A在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及其臨床意義的初步研究[J];中國(guó)婦產(chǎn)科臨床雜志;2014年03期

相關(guān)會(huì)議論文 前1條

1 王莉;張海林;;大鼠心肌肥厚模型的建立及TMEM16A的表達(dá)變化研究[A];細(xì)胞—生命的基礎(chǔ)——中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)2013年全國(guó)學(xué)術(shù)大會(huì)·武漢論文摘要集[C];2013年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 王凱;TMEM16A對(duì)高肺血流性肺動(dòng)脈高壓調(diào)控機(jī)制的研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 曹敬;脂多糖對(duì)離體大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞TMEM16A的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2014年

2 李楊楊;脂多糖對(duì)大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞氯離子通道TMEM16A表達(dá)影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2012年

，

本文編號(hào)：1938414